[发明专利]一种适用于多种典型模式微生物的高强度启动子

说明书

本发明公开了一种适用于多种典型模式微生物的高强度启动子，本发明是以P43启动子为基础，通过随机突变和高通量筛选获得了7个高强度启动子序列(PM1～PM7)，并在多种典型模式微生物中使用质粒中进行游离表达，证明了其有效性和通用性。

技术领域

本发明涉及一种适用于多种典型模式微生物的高强度启动子，属于启动子工程技术领域。

背景技术

启动子是RNA聚合酶最初识别、结合以及开始转录的DNA序列，是基因转录调控的关键元件，包含转录起始位点所需的保守序列以及RNA聚合酶的结合位点，大部分位于转录基因的上游，不会被转录。

随着生物研究的快速发展，启动子将更多的应用到代谢工程改造等重要方面，启动子工程的丰富与发展也使得人们可以更加便捷的获取适合研究所需的启动子。但总的来看，具有高表达强度且适用于多种微生物的启动子数量仍十分有限，开发新的具有高效性和通用性的启动子显得尤为重要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种高效的基因表达元件，即适用于多种典型模式微生物的高强度启动子。

本发明的第一个目的是提供一种适用于多种典型模式微生物的高强度启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～7所示。

进一步地，所述的高强度启动子用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。

进一步地，所述大肠杆菌为Escherichia coli MG1655、Escherichia coli BL21或Escherichia coli Nissle 1917。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。

进一步地，所述苏云金芽孢杆菌为Bacillus thuringiensis HD-1。

进一步地，所述的高强度启动子用于大肠杆菌时，以pPUC为表达载体。

进一步地，所述的高强度启动子用于枯草芽孢杆菌时，以pP43NMK为表达载体。

进一步地，所述的高强度启动子用于苏云金芽孢杆菌时，以pP43NMK为表达载体。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达目的蛋白的方法，是采用所述的高强度启动子启动目的蛋白的表达。

进一步地，所述的方法具体是将高强度启动子的序列添加到目的蛋白核苷酸序列的前端，构建到重组表达质粒中，再转化至宿主细胞中进行表达。

本发明的有益效果是：

本发明以荧光强度表征蛋白表达量，经过流式细胞仪的高通量筛选，获得了7个突变的强启动子(PM1～PM7)。发酵时间为10h小时左右时，能够使GFP表达水平最高提高36.4倍。用PM1～PM7在pP3NMK质粒上表达GFP，并分别在Bacillus thuringiensis HD-1、Bacillus subtilis 168中进行表征。结果显示，在Bacillus thuringiensis HD-1中，PM5控制下的GFP表达水平比原始P43启动子和RBS控制下的GFP表达水平高出8.6倍；在枯草芽孢杆菌中，PM4控制下的GFP表达水平比具有相同RBS的强启动子P566控制下的高3.2倍。用PM1～PM7在pPUC质粒上表达GFP，进一步在大肠杆菌中检测表达突变体启动子强度。结果表明，突变体PM4在大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BL21和大肠杆菌Nissle1917中均具有最高GFP表达水平，分别比具有相同RBS的强启动子Ptac控制下的GFP表达水平提高0.3、0.3和0.7倍。这些结果证明了以上经随机突变和高通量筛选获得的高强度启动子突变体在多种典型模式微生物中的有效性和通用性。

附图说明