[发明专利]一种筛选群体感应抑制剂并同时确定其作用靶点的方法

说明书

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于铜绿假单胞菌群体感应系统抑制剂筛选以及同时确定抑制剂作用靶点的方法。包括：构建QS抑制剂筛选系统，且该QS抑制剂筛选系统以蛋白酶为筛选标志；构建蛋白酶基因缺失的突变体，其在共培养过程中提供QS信号分子；采用共培养或外源添加QS信号分子的方式，筛选出对QS系统具有抑制作用的化合物并确定该化合物的作用靶点。本发明建立了一种简单、快捷、有效的且可以用于高通量QSI筛选的方法，在筛选的同时能够确定其作用靶点。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种筛选群体感应抑制剂并同时确定其作用靶点的方法，更具体的涉及一种用于铜绿假单胞菌群体感应系统抑制剂筛选以及同时确定抑制剂作用靶点的方法。

背景技术

群体感应系统(Quorum sensing，QS)是细菌种群的一种通信系统，具有协调基因表达，调节群体行为等功能。其中，QS系统调控的相关毒力因子在病原菌的致病性过程起到非常重要的作用。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种机会性致病细菌。随着抗生素的广泛使用，PA通过多种机制产生了耐药或多重耐药性，使其难以治疗和根治。PA拥有至少三种QS信号系统，通过相互作用在致病及耐药性的产生过程也发挥重要的作用。能抑制信号分子的自我诱导或生物合成阻断QS系统调控过程被认为是一种控制病原菌耐药及致病过程的新策略，能实现这一过程的化学物质则称为群体感应抑制剂(Quorumsensing inhibitors，QSI)。研究表明，报道的QSI候选化合物来源广泛，同样，筛选QSI的方法也是多种多样，例如：报告菌株检测法(包含发光报道子，荧光报道子，紫色色素报告菌株等)、表型检测法、生物芯片或qPCR法等。其中生物指标菌株检测法及发光报道子检测法使用比较广泛，常用的就是根据紫罗兰杆菌产生紫色色素的产量变化，GFP等蛋白或者发光报道子作为检测指标。例如：Toshiko等人研究发现放线菌代谢产物降低紫色杆菌CV026的紫色色素产量，暗示其代谢产物中可能含有QSI。荧光报道子法是将绿色荧光蛋白和QS相关基因融合表达，通过检测GFP表达量来筛选有效的QSI。

紫色色素报告菌株，发光报道子或者荧光报道子系统除了受到QS信号的调控，易受外界其他环境因子的影响。例如发光报道子就由于需要大量的能量从而受到细胞代谢的显著影响。此外，现有的筛选系统无法精确确定候选化合物作用的精确靶点，想进一步确定QSI的作用靶点还需要通过多个方法联合使用，最终才能确定候选化合物是QSI以及其作用靶点。因此，需要一种有效的QSI筛选方法并能够在筛选的同时确定其作用靶点。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了具体涉及一种筛选群体感应抑制剂并同时确定其作用靶点的方法，更具体的涉及一种用于铜绿假单胞菌群体感应系统抑制剂筛选以及同时确定抑制剂作用靶点的方法。

本发明的目的是提供一种简便，快捷筛选铜绿假单胞菌群体感应系统抑制剂并同时确定该化合物作用机制的方法，包括：

构建QS抑制剂筛选系统，且该QS抑制剂筛选系统以蛋白酶或发光报道子为筛选标志；

构建蛋白酶基因缺失的突变体，其在共培养过程中提供QS信号分子；

采用共培养或外源添加QS信号分子的方式，筛选出对QS系统具有抑制作用的化合物并确定该化合物的作用靶点；

其中，所述共培养是指将QS抑制剂筛选系统、蛋白酶基因缺失的突变体与化合物混合培养；

所述外源添加QS信号分子是指将QS抑制剂筛选系统、化合物与外源QS信号分子混合培养。

优选的，所述QS抑制剂筛选系统包括Las筛选系统、Rhl筛选系统和含发光报道子pKD-pqsA的Pqs筛选系统。