[发明专利]漆酶Bc-LAC及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了来自灰霉菌(Botrytis cinerea)的漆酶Bc‑LAC及其编码基因与应用。将漆酶Bc‑LAC的编码基因构建到毕赤酵母中，得到产漆酶Bc‑LAC重组菌，30升发酵罐的发酵活力达到15.83U/mL，重组酶能够有效降解水稻秸秆和玉米秸秆中的木质素。漆酶Bc‑LAC在pH2.5时，催化活性最高，具有较好的pH稳定性；温度为40℃时，漆酶Bc‑LAC的催化活性最高；经金属离子(如Cu²⁺)处理后，漆酶Bc‑LAC的催化活性可提高10.6％左右。漆酶Bc‑LAC可广泛用于造纸、环保、食品和饲料等领域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及漆酶Bc-LAC及其编码基因与应用。

背景技术

木质纤维素是数量最丰富的可再生生物质，据估计，每年全世界木质纤维素的生产量达到1×10⁸亿吨。尤其是来自农业和林业工业的木质纤维素废弃物，它们成本低、数量多。木质纤维素主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，其复杂的结构使得木质纤维素难以被降解和利用。其中，木质素作为物理屏障，阻止可以被消化纤维素和半纤维素被降解。因此，木质素的去除能够改变木质纤维素的结构特征，增加水解酶对纤维素和半纤维素的接触性。生物预处理是降解木质素最有效的方式，在此过程中主要发挥作用的木质素降解酶，如过氧化物酶和漆酶。

然而，在天然菌株中，木质素降解酶的产量低，在经济上无法大规模生产。研究表明，基因工程技术对提高酶的表达量和稳定性非常有用。

漆酶(EC 1.10.3.2)又称酚氧化酶或多铜氧化酶，能利用分子氧来催化氧化各类芳香族和非芳香族物质，是降解木质素的主要酶系之一。漆酶广泛分布于原核生物、植物、真菌以及昆虫之中。大多数漆酶是糖蛋白，分子量主要约为60-80kDa，最适pH值偏酸，最适温度较低，一般在26～50℃之间。漆酶底物谱宽泛，而且仅利用分子氧作为电子受体而无需过氧化物，对环境友好，这些特性促使其在染料脱色、农药脱毒、木质素降解、食品加工和制药行业等领域得到广泛应用。

漆酶的底物范围比较广。据统计，漆酶可以催化的底物达250种，包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素和生物色素、金属化合物和其他非酚类底物。不同来源的漆酶，底物特异性也不同。广泛用于测定漆酶活力的底物有愈创木酚、丁香醛连氮和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)。漆酶广泛的底物谱使得其在木质纤维素的降解利用方面有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的漆酶Bc-LAC及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供漆酶Bc-LAC，所述漆酶包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)来自灰霉菌(Botrytis cinerea)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的酶。

第二方面，本发明提供编码所述漆酶的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CDS序列如SEQ ID NO:2所示。按照毕赤酵母密码子偏好性优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，其编码的漆酶蛋白不含信号肽。

第三方面，本发明提供含有所述基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

第四方面，本发明提供一种产漆酶Bc-LAC的重组菌，所述重组菌是将编码漆酶Bc-LAC的基因经密码子优化后，通过质粒导入酵母中或通过基因工程手段整合到酵母染色体上构建得到的。

优选地，所述酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)，更优选毕赤酵母X33。