[发明专利]抗除草剂基因的产生及其用途

权利要求书

1.一种产生除草剂抗性植物，优选非转基因除草剂抗性植物的方法，包括将用于对植物基因组中的除草剂抗性相关基因进行碱基编辑的系统导入植物，由此所述向导RNA将所述碱基编辑融合蛋白靶向所述植物中的除草剂抗性相关基因的靶序列，导致所述序列中的一或多个核苷酸取代，所述系统包含以下i)至v)中至少一项：

i)碱基编辑融合蛋白，和向导RNA；

ii)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；

iii)碱基编辑融合蛋白，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

v)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

其中所述碱基编辑融合蛋白包含核酸酶失活的Cas9结构域和脱氨酶结构域，所述向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向植物基因组中的除草剂抗性相关基因的靶序列，

其中所述一或多个核苷酸取代赋予所述植物除草剂抗性，

任选地，所述方法还包括针对除草剂抗性对植物进行筛选的步骤，

其中所述除草剂抗性相关基因编码除草剂抗性相关蛋白ALS；并且所述向导RNA靶向包含编码选自A122、P197、R198、D204、A205、G654、G655、G659或其任意组合的氨基酸的序列的靶序列，其中所述氨基酸位置参考SEQ ID No：2。

2.权利要求1的方法，所述碱基编辑融合蛋白包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列。

3.权利要求1的方法，所述向导RNA靶向SEQ ID NO:19-22、43-45、49-51和64中一或多个序列。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述植物选自单子叶植物和双子叶植物，例如，所述植物选自小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯、马铃薯、卷心菜、甘蓝、黄瓜、番茄、康乃馨、牡丹、玫瑰、西瓜、甜瓜、草莓、蓝莓、葡萄、苹果、柑橘、桃、板蓝根、甘草、人参、防风和拟南芥。

5.一种鉴定除草剂抗性相关蛋白的变体的方法，所述变体能够赋予植物除草剂抗性，所述方法包括：

i)通过权利要求1的方法产生除草剂抗性植物；和

ii)鉴定所产生的除草剂抗性植物中所述除草剂抗性相关基因序列和/或其编码的除草剂抗性相关蛋白序列，从而鉴定所述变体的序列。

6.权利要求5的方法，所述除草剂抗性相关蛋白为ALS。

7.一种除草剂抗性相关蛋白的变体，其通过权利要求5或6的方法鉴别，所述变体能够赋予植物除草剂抗性。

8.一种ALS变体，所述ALS变体相对于野生型ALS在选自122、197、198、204、205、653、654、655、659的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：2，所述变体赋予植物除草剂抗性。

9.权利要求8的变体，其中所述植物选自单子叶植物和双子叶植物，例如，所述植物选自小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯、马铃薯、卷心菜、甘蓝、黄瓜、番茄、康乃馨、牡丹、玫瑰、西瓜、甜瓜、草莓、蓝莓、葡萄、苹果、柑橘、桃、板蓝根、甘草、人参、防风和拟南芥。

10.一种分离的核酸，其包含编码权利要求7-9中任一项的变体的核苷酸序列。

11.一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码权利要求7-9中任一项的变体的核苷酸序列。

12.一种表达构建体，其包含编码权利要求7-9中任一项的变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列与调控序列可操纵地连接。