[发明专利]一种多功能纳米诊疗剂及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种多功能纳米诊疗剂及其制备方法与应用。该纳米诊疗剂是以季铵盐和厄洛替尼共修饰的壳聚糖为载体，将其与Cy5和Cy7共修饰的分子信标通过静电相互作用自组装制得。其中，所用载体依次经季铵盐、厄洛替尼修饰后形成高正电基团，其水溶性增强，并能够主动靶向识别表皮生子因子受体敏感突变的非小细胞肺癌；所用分子信标能够特异性识别T790M突变，并实现对T790M突变程度的实时监测；而其两端修饰的Cy5和Cy7在长期用药进程中可发挥双重PDT效果。因此，该纳米诊疗剂在长期用药过程中能够实现对T790M突变程度的实时监测，并能够协同分子靶向治疗和双重PDT，改善获得性耐药，最大程度抑制肿瘤细胞增殖。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种无创性可实时监测肺癌治疗疗效拐点并协同分子靶向治疗和双重光动力治疗、用于逆转获得性耐药的多功能纳米诊疗剂及其制备方法与应用。

背景技术

肺癌是一种恶性肿瘤，严重威胁生命健康，已成为我国及世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。从组织学角度，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC），其中后者占80-85%左右，是肺癌特异性死亡的主要原因。NSCLC患者中，表皮生长因子受体（EGFR）活性突变是最常见的可靶向驱动突变类型，在各类型患者（如亚洲患者、女性及无吸烟史患者）中发生率最高，因此针对EGFR敏感突变的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）成为治疗NSCLC的一线用药。

以厄洛替尼（Er）为代表的第一代EGFR-TKI分子靶向药极大延长了EGFR敏感突变的NSCLC患者的无进展生存期，但患者用药9.2-14.7个月后均不可避免地产生获得性耐药进而导致疾病进展。获得性耐药机制通常包括下游通路异常、向SCLC转化、肿瘤生理异常化、肿瘤微环境限制二级突变等，其中约60%患者出现二级突变，如T790M点突变、MET扩增和HER2扩增等。T790M突变在二级突变中占50-55%左右，在核酸水平表现为从胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的突变，蛋白水平表现为由蛋氨酸取代苏氨酸的T790M突变产生，导致EGFR-TKI后期治疗效果显著下降，而目前仍无可及时有效监测EGFR-TKI疗效拐点的方法。

当前对EGFR-TKI用药指导主要依靠组织活检，但该方法具有高度的入侵性，不适合评估肺癌治疗疗效拐点及监测肿瘤细胞基因型的动态变化，因此有多种无创性的核酸检测技术被用于NSCLC患者基因突变检测。多聚酶链式反应（PCR）和实时定量多聚酶链式反应（RT-PCR）被认为是核酸检测的金标准，可用于体液和血液中DNA检测，但这些方法需要引物设计，昂贵的仪器，成本高，耗时，对操作者有技术要求，因而实际应用受到限制。

分子信标（MB）是一段寡核苷酸，由茎干区和环状区构成并在游离状态下维持“发夹”结构，MB两端用荧光素标记，可通过碱基互补配对原则靶向识别mRNA，常基于荧光共振能量转移（FRET）机理，通过荧光素之间距离的变化可用于基因点突变的分析，能够实现可视化检测肿瘤相关因子的表达和对疗效拐点快速、灵敏的体内即时监测。其中，花青素Cy5/Cy7是常见的FRET供体-受体对。另外，MB核酸链和互补序列之间具备独特灵敏性和特异性的分子识别能力，极大促进了MB用于精准治疗的研究，如联合MB用于基因治疗、或通过选用具有光敏活性的荧光基团使MB发挥光动力治疗（PDT）作用，为逆转获得性耐药提供新的思路。

PDT是一种新型、无创性、相对安全、精准可控的治疗方法，现已被广泛研究用于炎症、自身免疫疾病、传染性疾病和肿瘤等方面的治疗。同传统的治疗方式如化疗和放射疗法相比，PDT展示出不可替代的优势：无创性和低的全身毒副作用、几乎无耐药反应、可以同其他的治疗方法联合使用。PDT过程中，光敏剂在肿瘤部位聚集并被特定波长激光（600-800nm）所激发，在机体和细胞内氧分子的参与下触发光化学反应，引起细胞产生活性氧（ROS），通过氧化应激破坏细胞内的生物大分子或激活机体抗肿瘤免疫反应进而杀死肿瘤细胞。MB“发夹”结构末端的荧光素距离相近，供体荧光被淬灭，当MB靶向识别特定序列后，供体荧光恢复，光活性增强，光动力效果增强，为治疗疗效提供有意义的反馈，并为精准诊疗提供重要依据。