[发明专利]牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条

权利要求书

1.一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于将初筛试纸条(试纸条1)和确诊试纸条(试纸条2)共置于同一个外壳框内，形成一个新的检测单元；其中试纸条1和试纸条2均分别由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述初筛试纸条和确诊试纸条的样品垫相连接，连接处设置有加样孔；使用时，取待检血清滴入加样孔，根据试纸条1和试纸条2呈现出的结果，对待检样本做出布病阴性、阳性或可疑的判定。

2.如权利要求1所述一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条1金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS和胶体金标记的鼠源抗Flag标签单克隆抗体，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4，质控线包被羊抗鼠IgG抗体。

3.如权利要求1所述一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条2金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌LPS，检测线包被兔抗牛IgG抗体，质控线包被布鲁氏菌单克隆抗体M4。

4.如权利要求2、3所述一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述胶体金标记的布鲁氏菌LPS制备方法为：

将灭活布鲁氏菌S2菌悬液以10000g离心20分钟，收集沉淀，采用热酚水法提取布鲁氏菌LPS，提取的上清液用蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，此即纯化的LPS；

取胶体金溶液10mL至离心管中，加入适量的0.1MK₂CO₃溶液，使pH值约为7.5，取制备的LPS溶液140μL加入到胶体金溶液中，室温孵育20min，加入牛血清白蛋白(BSA)0.02g使其终浓度为0.2％，充分混匀，4℃条件下，10000r/min离心40min，弃上清，用2mL0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀，此即胶体金标记的LPS。

5.如权利要求2、3所述一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体M4制备方法为：

用猪种布鲁氏菌S2株灭活菌液(1×10¹⁰CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫，加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与布鲁氏菌LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157菌株、小肠结肠炎耶尔森菌O9菌株的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株M4，将其扩大培养并纯化，制得单克隆抗体M4；

以上猪种布鲁氏菌S2株(CVCC70502)、大肠杆菌O157(CVCC1489)均来自国家兽医微生物菌种保藏中心；小肠结肠炎耶尔森氏菌O9(CMCC52218)来自中国医学细菌保藏管理中心。

6.如权利要求1所述一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于采用布病阳性血清标准品(牛源，含量1000IU/mL)对试纸条1和试纸条2的检测灵敏度进行定量，检测灵敏度均为50IU/mL。

7.如权利要求6所述一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于所述试纸条1和试纸条2的检测灵敏度的定量方法为：

用生理盐水将牛源布病阳性血清标准品进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等4个不同稀释度备用，即血清抗体含量为100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL，滴加2滴各稀释度阳性血清(100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果；确定试纸条1和试纸条2检测灵敏度结果：牛源布病阳性血清标准品稀释1∶20(即50IU/mL)，试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为阳性；牛源布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)，试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为阴性。

8.如权利要求1所述一种牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条，其特征在于按照如下步骤进行：

(1)样本处理：取动物全血，分离血清，血清应清亮，无溶血；

(2)操作方法：滴加2滴血清(100μL)于加样孔内，在2～5分钟内读取结果；

(3)判定标准：当试纸条1检测线和质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病阴性(－)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线和质控线均有条带，判为布病阳性(+)；当试纸条1检测线无条带而质控线有条带，试纸条2检测线无条带而质控线有条带，判为布病可疑(±)；当试纸条1或试纸条2出现质控线无条带，判为无效。