[发明专利]一种铁蛋白的制备方法

说明书

本发明提供了一种铁蛋白的制备方法，属于生物技术领域。该制备方法包括：构建无标签铁蛋白的大肠杆菌重组表达菌株；发酵大肠杆菌重组表达菌株，得到发酵液；利用高压均质机粗提取发酵液中的铁蛋白，得到粗提铁蛋白；采用液相色谱纯化粗提铁蛋白，得到铁蛋白。该制备方法采用高压均质机对铁蛋白重组菌的破壁提取问题，相比于传统的超声处理该方法效率高，可进行规模化放大，从而提高了铁蛋白的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及铁蛋白的制备方法。

背景技术

铁蛋白是动物、植物及微生物细胞中普遍存在的一种蛋白质，由12个或24个蛋白亚基自组装成球形笼状蛋白壳，内径约8nm，外径约12nm。铁蛋白具有天然的笼状结构，该结构是一个优良的生物反应器，科学家在酸性条件下利用还原剂去除天然提取的铁蛋白的水合氧化铁内核，得到空壳铁蛋白，在铁蛋白空壳内合成磁铁矿纳米颗粒。磁铁矿纳米颗粒具有良好的应用前景。

目前，获得铁蛋白的实验室操作步骤包括：摇床进行扩大培养、超声波破壁提取铁蛋白和液相色谱纯化铁蛋白。其中，超声波破壁也是实验室破碎细胞最常用的方法之一，但是超声破壁处理样品规模小，效率低，无法规模化放大。因此，欲克服铁蛋白产量的限制，须克服铁蛋白重组菌的破壁提取问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种铁蛋白的制备方法，能够大规模生产铁蛋白。

本发明实施例提供一种铁蛋白的制备方法，包括：

构建无标签铁蛋白的大肠杆菌重组表达菌株；

发酵所述大肠杆菌重组表达菌株，得到发酵液；

利用高压均质机粗提取所述发酵液中的铁蛋白，得到粗提铁蛋白；

采用液相色谱纯化所述粗提铁蛋白，得到所述铁蛋白。

具体地，所述利用高压均质机粗提取所述发酵液中的铁蛋白的方法包括：

向所述发酵液中加入终浓度为0.5～2mM的乙二胺四乙酸溶液，得到第一混合液；

向所述第一混合液中加入磷酸缓冲盐溶液，得到第二混合液；

用氢氧化钠溶液调节所述第二混合液的pH值至7.0～9.0，得到第三混合液；

用所述高压均质机在90MPar～130MPar的压力下均质处理所述第三混合液；

向均质后的所述第三混合液中加入终浓度为0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚或聚氧乙烯单叔辛基苯基醚，得到第四混合液；

在搅拌条件下，于60～80℃加热所述第四混合液15～30分钟，并于10000g下离心30分钟，得到第一上清液；

浓缩所述第一上清液，并于4℃静置2～3天，经离心得到第二上清液，即粗提取的所述铁蛋白。

进一步地，浓缩所述第一上清液的方法为利用中空纤维浓缩系统进行浓缩，浓缩条件为：中空纤维柱截留蛋白分子量100KDa，流速2～5L/min，压力小于0.5psi。

具体地，所述构建无标签铁蛋白的大肠杆菌重组表达菌株的方法包括：

将所述铁蛋白的序列进行密码子优化，得到优化铁蛋白序列；

合成所述优化铁蛋白序列；

将所述优化铁蛋白序列插入载体的多克隆位点上，利用酶切位点进行酶切，得到重组载体；

将所述重组载体导入大肠杆菌菌株中，构建铁蛋白的异源表达体系并筛选正确的重组表达菌株。

具体地，所述发酵所述大肠杆菌重组表达菌株的方法包括：