[发明专利]一种铁蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种铁蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

构建无标签铁蛋白的大肠杆菌重组表达菌株；

发酵所述大肠杆菌重组表达菌株，得到发酵液；

利用高压均质机粗提取所述发酵液中的铁蛋白，得到粗提铁蛋白；

采用液相色谱纯化所述粗提铁蛋白，得到所述铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述利用高压均质机粗提取所述发酵液中的铁蛋白的方法包括：

向所述发酵液中加入终浓度为0.5～2mM的乙二胺四乙酸溶液，得到第一混合液；

向所述第一混合液中加入磷酸缓冲盐溶液，得到第二混合液；

用氢氧化钠溶液调节所述第二混合液的pH值至7.0～9.0，得到第三混合液；

用所述高压均质机在90MPar～130MPar的压力下均质处理所述第三混合液；

向均质后的所述第三混合液中加入终浓度为0.5％～2％的聚乙二醇辛基苯基醚或聚氧乙烯单叔辛基苯基醚，得到第四混合液；

在搅拌条件下，于60～80℃加热所述第四混合液15～30分钟，并于10000g下离心30分钟，得到第一上清液；

浓缩所述第一上清液，并于4℃静置2～3天，经离心得到第二上清液，即粗提取的所述铁蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，浓缩所述第一上清液的方法为利用中空纤维浓缩系统进行浓缩，浓缩条件为：中空纤维柱截留蛋白分子量100KDa，流速2～5L/min，压力小于0.5psi。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述构建无标签铁蛋白的大肠杆菌重组表达菌株的方法包括：

将所述铁蛋白的序列进行密码子优化，得到优化铁蛋白序列；

合成所述优化铁蛋白序列；

将所述优化铁蛋白序列插入载体的多克隆位点上，利用酶切位点进行酶切，得到重组载体；

将所述重组载体导入大肠杆菌菌株中，构建铁蛋白的异源表达体系并筛选正确的重组表达菌株。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵所述大肠杆菌重组表达菌株的方法包括：

种子制备：将铁蛋白表达工程菌在固体LB培养基上进行活化，于37℃培养12小时，得到单菌落；

摇床培养一级种子：挑取所述单菌落，接种至一级种子培养基中，于37℃摇床震荡培养12小时，得到一级种子液；

摇床培养二级种子：将所述一级种子液按照种子培养基体积0.1％的接种量接种到二级种子培养基中，于37℃摇床震荡培养8小时，得到二级种子；

发酵培养：将所述二级种子按发酵体积4％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵，待所述发酵培养基中的葡萄糖耗尽后补加补料培养基，待菌体浓度生长至OD600达到30～40之间后开始加入终浓度为0.5～1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导铁蛋白，待OD值不再上升后，停止发酵培养。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述一级种子培养基和所述二级种子培养基均包括：胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为10g/L，所述酵母提取物的浓度为5g/L，所述氯化钠的浓度为10g/L。