[发明专利]一种双标记劈裂适配体探针及其在无酶扩增一步法快速检测双酚A中的应用

说明书

本发明属于生物工程和生物分子检测技术领域，具体涉及一种双标记劈裂适配体探针及其在无酶扩增一步法快速检测双酚A中的应用。本发明利用双标记的SPA探针，将两个荧光信号用一个BPA分子猝灭，实现无酶扩增，显著提高了检测灵敏度。同时，在均相溶液中，只需一步法即可实现BPA的检测。此外，SPA探针具有较高的选择性，可用于食品样品基质中BPA的检测。由于操作简单、响应时间快、灵敏度高、选择性好，因此本发明双标记SPA探针在食品安全等领域具有广泛的应用潜力。

技术领域

本发明属于生物工程和生物分子检测技术领域，具体涉及一种双标记劈裂适配体探 针及其在无酶扩增一步法快速检测双酚A中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被 视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

双酚A(bisphenol A，BPA)广泛用于环氧树脂和聚碳酸酯聚合物的合成，以制造塑料食品容器和包装材料。因此，BPA可以在食品加工或储存过程中从食品接触材料转移 到食品中。由于BPA具有雌激素模拟作用，长期接触BPA会影响内源性激素的平衡、增 加癌症风险，并导致免疫紊乱、动脉粥样硬化和其他疾病。考虑到其迁移性和潜在的风 险，各国和地区颁布了BPA的限量标准，以限制BPA的应用。为了保护婴幼儿的健康， 欧盟委员会自2011年起禁止在婴儿塑料瓶中使用BPA。因此，开发可靠、灵敏的BPA检 测方法对保证人体健康至关重要。

近年来，已经发展了几种测定BPA的分析技术。基于仪器的方法包括高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)、液相色谱质谱(liquidchromatography mass spectrometry，LC-MS)、气相色谱质谱(gas chromatography massspectrometry， GC-MS)，是目前常用的BPA检测分析技术。这些方法准确性高，但需要昂贵的仪器、 专业人员和复杂的样品处理步骤。因此，进一步开发了更简单、更经济的BPA检测方法， 如免疫测定、电化学技术、表面增强拉曼散射(surface-enhanced Ramanscattering，SERS)、 比色法和荧光光谱法。在这些方法中，基于荧光的分析方法近年来受到越来越多的关注， 因为其具有响应快、灵敏度高、成本效益高和操作简单等优点。

在荧光检测中，适配体通常代替传统抗体用作识别元件，因为适配体具有许多优点， 包括易于合成、反应迅速和在条件稳定性等。根据适配体与靶标之间的识别机制，靶标诱导的适配体结构转换可以为信号转导提供理想的途径。然而，适配体的动态构象变化 可能会形成非特异性二级结构，从而干扰小分子目标物的识别及信号产生。

为了解决这一问题，利用劈裂适配体(split aptamer，SPA)来减少非特异性识别。通过将初始适配体合理地分为2-3个片段来设计SPA。目标分子可诱导劈裂后的两部分SPA同时结合，形成靶标/SPA三元复合物。因此，基于这种靶向诱导重组特性，SPA可 对目标分子保持生物识别活性。对于每个SPA，由于缺乏二级结构，无法形成完整的结 合位点来识别目标分子。两种SPA存在时，由于缺少二级结构，靶点/SPA复合物的生成 过程不涉及适配体结构的复杂构象变化，从而降低了对非靶点分子的非特异性识别。同 时，较短序列的低错误率和低合成成本促进了SPA的实际应用。此外，劈裂产生了更多 的寡核苷酸末端，为官能团提供了额外的修饰位点。因此，SPA作为识别探针被广泛应 用于荧光适配体传感器的设计中。

在基于适体的荧光检测中，一个目标通常只能释放或猝灭一个荧光信号，导致灵敏 度相对较低。因此，引入多种核酸信号扩增方法，如重组酶聚合酶扩增、环介导等温扩增和滚环扩增等。扩增后，适配体探针的检测灵敏度明显提高。然而，这些扩增过程需 要酶和精确的温度控制，检测过程复杂且耗时，这限制了它们在BPA现场检测中的应用。

发明内容