[发明专利]适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体

说明书

本发明公开了一种适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体。本发明在密码子优化的萤火虫荧光素酶基础上利用理性设计的方法改造荧光素酶的分子结构，得到热稳定性和活性均提高的荧光素酶突变体，其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3‑5所示。编码其蛋白质的核苷酸序列如SEQID NO.6‑8所示。突变体包括双突变位点T214N T290P、T214N K28R和A532RT214N中的至少一个。本发明获得的荧光素酶突变体，相比现有技术，其在293细胞中能够高效表达，并且表达产物具有高活性和高热稳定性的特点。

技术领域

本发明涉及一种适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

北美萤火虫(Photinus pyralis)中提取的荧光素酶的相对分子质量为60kDa，是由551个氨基酸残基构成的含有大量疏水氨基酸残基的单一多肽链。其由2个结构域组成，分别为N端结构域(1-436)和C端结构域(440-550)，通过中间的连接序列(436-440)联系在一起，两个结构域相对形成的裂口被认为是反应活性位点(薛秀花,黄晨西.荧光素酶基因的研究进展[J].生物学通报,2013,48(09):1-4；Zako T,Ayabe K,Aburatani T,etal.Luminescent and substrate binding activities of firefly luciferase N-terminal domain[J].BBA-Proteins and Proteomics,2003,1649(2):183-189.)。

荧光素酶的催化反应过程是：在氧气、ATP、Mg²⁺的条件下，荧光素酶催化底物荧光素氧化的同时发出荧光，此过程不需要激发光源，发光能量主要来自化学反应并且发光可持续一定的时间。因此，在科研、医药及食品行业等都有广泛的应用。

综合荧光素酶基因在科研和医药领域中的应用发现，其在基因表达、焦磷酸测序技术、药物筛选、标记微生物(示踪)、蛋白质相互作用研究、RNA干扰、标记细胞活体成像、检测细胞凋亡等多方面有广泛的应用。除此之外，荧光素酶在食品行业也具有广阔应用前景，因荧光素-荧光素酶发光体系灵敏度高，发光强度与体系中的ATP含量成正比，通过ATP的测定可以直接反应细胞或微生物的含量。随着荧光素酶的应用的普及，需求持续增多，研究具有高活性且对温度、pH耐受性良好，成本低廉的荧光素酶具有重要意义。

然而，野生型和重组型的荧光素酶很不稳定，当它们暴露于30℃，尤其是35℃以上时会迅速失去活性(许勇,张忠东,李静,王红萍,王娟,胡倩,赵娜娜.萤火虫Luc基因的克隆及生物信息学分析[J].生物技术,2020,30(04):328-334.DOI:10.16519/j.cnki.1004-311x.2020.04.0053.于浩然.理性设计改造荧光素酶的热稳定性[D].天津大学,2014.)。导致荧光素酶热稳定性差的原因如荧光素酶中大量的疏水氨基酸残基，二级结构中大量的无规则卷曲结构，荧光素酶结构中不含二硫键，这些都不利于维持蛋白质的结构稳定。制成试剂保存时易失活，因此对荧光素酶进行改造提高其活性和热稳定性在酶的应用上有重要的意义。近年来通过基因工程技术改造萤火虫荧光素酶的方法也已经成熟，如通过使用随机突变、半理性设计、理性设计、密码子优化等方法来探索酶的发光强度、稳定性、生物发光光学特性的变化规律等方面的特性，目前尽管在提高虫荧光素酶的稳定性及活性方面取得了一定进展，但目前该方面研究主要集中于西方国家。随着萤火虫荧光素酶在国内应用的普遍，非常有必要生产具有自主知识产权的高稳定性萤火虫荧光素酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有的荧光素酶存在热稳定性较差、易失活、酶活不高等问题。