[发明专利]一种靶向活化型肝星状细胞核酸适配体APT8的筛选方法

权利要求书

1.靶向活化肝星状细胞核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提供随机单链DNA文库，所述单链DNA文库包括下式表示的单链5'ATCCAGAGTGACGCAGCA(45N)TGGACACGGTGGCTTAGT3'，其中N45表示中间为45bp随机序列；以SEQ ID NO：8-9所示的核苷酸序列的引物对制备次级文库；

（2）单链DNA文库经变性后依次经正常肝脏细胞进行阴性筛选、HSC细胞进行阳性筛选获得第一轮筛选产物，所述的正常肝脏细胞包括肝细胞、肝窦内皮细胞或枯否细胞；

（3）以SEQ ID NO：8-9所示的核苷酸序列的引物对第一轮筛选产物进行PCR扩增，获得第二轮筛选产物；

（4）依次类推，由上一轮核酸适配体文库经变性、正常肝细胞进行阴性筛选、HSC细胞进行阳性筛选获得上一轮筛选产物，然后以步骤(1)所述引物对上一轮筛选产物进行PCR扩增获得下一轮核酸适配体文库；共筛选5轮，最终获得核酸适配体，所述的核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的DNA片段的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的靶向活化肝星状细胞核酸适配体的筛选方法，其特征在于，阴性筛选过程中在37℃的恒温摇床下，以120-150rpm孵育30-50min；阳性筛选过程中，HSC细胞经消化、稀释后制得细胞悬液，将该细胞悬液在37℃的恒温摇床下，以120-150rpm孵育60-80min。

3.根据权利要求1所述的靶向活化肝星状细胞核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：95℃5min；94℃30c，56-67℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；所述PCR循环条件为：95℃5min；94℃30c，55-66℃30s，72℃30s，19-37次循环后延伸；72℃5min。

4.根据权利要求3所述的靶向活化肝星状细胞核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1-7所示的任一条DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体能特异性进入活化HSC细胞。

5.根据权利要求4所述的靶向活化肝星状细胞核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述适配体至少包括一个化学修饰：对所述适配体核酸序列中的磷酸二酯键的修饰，包括硫代化修饰；对所述适配体核酸序列中核糖的修饰，包括2’-H被F、NH₂、或OMe的取代；对所述适配体核酸序列中的任意碱基进行氨基、羧基、巯基、生物素、胆固醇、或聚乙二醇基团的修饰；对所述适配体的核苷酸序列中5’端的聚乙二醇的修饰以及3’端的脱氧尿嘧啶、脱氧胸腺嘧啶或脱氧次黄嘌呤的修饰；所述适配体的核苷酸序列中的至少一个核苷酸为锁核酸。

6.采用权利要求1-5任一项所述筛选得到的靶向活化肝星状细胞核酸适配体在制备生物分子运输载体的药物上的应用，所述的生物分子包括核酸、寡肽、多肽、糖类、脂质、纳米颗粒、纳米嵌段或小分子化合物中的一种或任意的复合物，所述的核酸选自抗肝纤维化的si-RNA、或Micro-RNA。

7.包含药物运输载体的复合物，其特征在于，所述的复合物包含药物运输载体与可用作药物的分子，所述药物运输载体直接或者间接通过接头与可用作药物的分子连接；

其中，所述的药物运输载体为权利要求1-5任一项所述筛选得到的靶向活化肝星状细胞核酸适配体；所述的可用作药物的分子包括核酸、寡肽、多肽、糖类、脂质、纳米颗粒、纳米嵌段或小分子化合物中的一种或任意的复合物。

8.根据权利要求7所述的复合物在制备治疗或诊断肝纤维化疾病的药物上的应用。

9.根据权利要求8项所述的应用，其中所述细胞是哺乳动物细胞。