[发明专利]一种利用扫描电化学显微镜（SECM）检测不可逆电穿孔程度的方法

说明书

本发明涉及一种利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其通过对脉冲电场刺激后的细胞的膜通透性(Pm)进行测定，实现细胞电穿孔程度的快速高效检测。该方法先测定出SECM探针对细胞的逼近曲线，再将逼近曲线换算成细胞膜通透性来完成对电穿孔程度的测定，并通过已有的检测方法测定细胞的存活率曲线，将Pm值与细胞存活率建立关系，来验证细胞膜通透性能完成不可逆电穿孔的检测，发现细胞膜通透性随脉冲电压变化的规律与细胞存活率在脉冲电压变化时的规律几乎一致，因此利用SECM测定细胞的电穿孔程度的方法是有效可靠的。

技术领域

本申请涉及一种利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔的方法，其通过对细胞的膜通透性(Pm)进行测定，实现电穿孔程度的快速高效检测。更具体地，本申请涉及用于在生物组织的细胞上施加不可逆电穿孔脉冲消融后，再对其进行膜通透性测定，判断出不同脉冲条件对不同细胞造成的电穿孔程度。

背景技术

恶性肿瘤使人体正常的机能代谢受影响，严重地损害了各脏器的正常功能，是危及人体健康、生命的疾病。国际癌症研究机构发布的2020年全球肿瘤发病率和死亡率估算数据统计显示：2020年全球新增肿瘤病例达1930万例，而肿瘤死亡人数近1000万。肿瘤治疗一直是全球科学家乃至整个社会致力突破的领域，尽管投入了大量的时间和精力，肿瘤的攻坚之路仍是困难重重，所以找寻安全、有效和特异性的肿瘤治疗手段仍是重点所在。

脉冲电场(PEF)消融作为一种物理微创消融手段，相比物理热疗法而言，有着非热选择性的优点，能够避免热沉效应，且产生的热量很小，不会对周围结构造成热损伤，能应用于靠近血管等重要器官结构的肿瘤治疗。其是通过将细胞暴露在极短而超强的电场中，癌细胞在受到电刺激后，细胞膜上会出现纳米级微孔使膜通透性增加，即细胞的电穿孔，根据微孔是否会自我闭合将脉冲电场消融技术分为可逆电穿孔和不可逆电穿孔消融。不可逆电穿孔采用了更强有力的脉冲条件，使得产生的微孔不能进行自我修复，细胞膜的完整性被破坏，从而诱导了细胞的凋亡。

然而，细胞在受到脉冲电场的刺激后，不同的细胞在不同的脉冲参数下形成的电穿孔程度不尽相同，这是该方法具有可特异性治疗不同肿瘤的重要特征。为了达到有效、稳定、安全的杀伤效果，为此，需要采用针对不同肿瘤细胞予以筛选，提前摸索出在不同条件下的电穿孔程度。目前的电穿孔检测方法主要是通过对加入物的追踪检测、对细胞内流出物的检测以及对物理性质的变化的监测来完成的，然而，考虑到可用的设备和所使用的实验条件，它们仍存在着各自的缺点，如需要对细胞进行清洗、使用物有一定的细胞毒性、检测时间长、准确度低等一系列问题。

为此，急需构建一种有效的电穿孔检测方法去评估电穿孔的程度，建立起其与脉冲条件的联系。扫描电化学显微镜(SECM)作为一种非侵入型的电化学测量方法，将探针显微镜和超微电极电化学相结合，可以绘制表面反应性，从而评估表面反应动力学和表面化学成像，在生物医学领域的应用尤为突出，其中，已经有学者专家使用该方法成功测出细胞暴露在金属离子下的细胞膜通透性改变情况，ZhangM.N.等利用SECM对顺铂诱导的人类膀胱癌细胞(T24)进行测定，在深度扫描模式下运行SECM，可以同时量化细胞形态和膜通透性，结果表明，向T24细胞外环境中加入顺铂可在5分钟内立即引起细胞膜通透性的改变。FiliceF.P.等使用SECM的深度扫描成像来监测T24细胞在不同浓度Cr(VI)刺激下的膜通透性，结果发现低浓度Cr(VI)在较短的孵化时间内，膜通透性基本不受影响，随着时间的增加，细胞膜通透性显著增加，并且随着浓度的增大会加速膜通透性的变化。而不可逆电穿孔技术是通过电脉冲手段来改变细胞膜通透性达到肿瘤治疗，但目前没有较好的检测手段，采用SECM去检测不可逆电穿孔后的细胞膜通透性，建立起其与电穿孔效率的联系，开发出一种针对膜通透性的快速高效的不可逆电穿孔检测方法具有极为重要的意义。

发明内容