[发明专利]一种利用扫描电化学显微镜（SECM）检测不可逆电穿孔程度的方法

权利要求书

1.一种利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，能够特异性地针对细胞的膜通透性，快速高效地对脉冲电场刺激后的细胞进行电穿孔程度测定，具体包括如下步骤：

细胞培养到一定细胞密度后，用高压脉冲发生器对细胞进行不可逆电穿孔消融，消融结束后不用更换培养皿，直接将细胞培养液换成氧化还原介质，再用扫描电化学显微镜对细胞进行探针逼近，测定出SECM探针对细胞的逼近曲线，然后将细胞探针逼近曲线与模拟出来的标准探针逼近曲线相对应，换算成细胞膜通透性(Pm)值来完成对电穿孔程度的测定。

2.根据权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，能利用SECM探针手段将Pm值与细胞电穿孔后存活率建立关系，构建标准库，来进一步验证和判断不可逆电穿孔的程度。

3.根据权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，扫描电化学显微镜使用的探针电极为超微电极，可以是铂电极、金电极等。

4.根据权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，扫描电化学显微镜采用的模式是负反馈工作模式，在细胞所处溶液环境中加入氧化还原介质以产生法拉第电流，观察电流变化确定膜通透性程度。

5.根据权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，所采用的氧化还原介质需要满足不能正常穿透细胞膜，对细胞不会产生毒副作用，可以是二茂铁甲醇、二茂铁乙醇等系列化合物。

6.根据权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，所测定的细胞需要满足能贴壁生长在培养皿上，可以为不同的正常细胞或肿瘤细胞。

7.根据权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，对应的标准探针逼近曲线需要采用仿真软件模拟，将实验所得的逼近曲线与标准曲线相对应，以得出不同脉冲电压电穿孔下的膜通透性，用膜通透性表示电穿孔程度，建立起不同脉冲参数与电穿孔程度的联系。

8.根据权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，扫描电化学显微镜工作时与不可逆电穿孔消融时的细胞都贴壁在培养皿中，施加的脉冲电场需要满足稳定覆盖培养皿底部，并且保证探针每次逼近区域所受的电场强度一致。

9.根据权利要求2所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，所述检测不可逆电穿孔检测手段，也可利用FESEM观察细胞膜成孔规律、MTT法测量细胞存活率等相关检测方法作为参考评价技术。

10.一种权利要求1所述利用扫描电化学显微镜(SECM)检测不可逆电穿孔程度的方法，其特征在于，能够特异性地针对细胞的膜通透性，快速高效地对脉冲电场刺激后的细胞进行电穿孔效率测定；不可逆电穿孔技术是通过改变细胞膜通透性达到肿瘤治疗，它通过脉冲电场改变细胞跨膜电压，使细胞通透性增加后凋亡，而扫描电化学显微镜能采用负反馈工作模式测定出细胞膜通透性，并且SECM样品制备简单，不需要细胞固定以及任何染色或标记步骤，在操作过程中探针也不需要接触细胞，不会对细胞产生损伤，检测时间短，5分钟即可测出对应脉冲参数下的逼近曲线。