[发明专利]一株高接合转移效率哈维弧菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株高接合转移效率哈维弧菌及其构建方法和应用。是将哈维弧菌的限制性内切酶BsuBI‑R基因敲除，所述的限制性内切酶BsuBI‑R基因是SEQIDNO.1的921bp‑1901bp。相比于基因工程出发菌，V.harveyi345‑ΔBsuBI‑R的接合转移效率显著提高，且获得的单交换克隆子阳性率高，筛选工作量少，开辟了哈维弧菌通过接合转移及同源重组进行基因敲除的平台，有利于进一步的基因组改造和基因功能研究。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高接合转移效率哈维弧菌及其构建方法和应用。

背景技术

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖生物的重要条件致病菌，对海水养殖产业造成了巨大的危害。华南沿海海水鱼病害调查发现，海水鱼类弧菌病约70％为哈维弧菌所致，哈维弧菌的危害范围和程度已逐渐取代了溶藻弧菌和创伤弧菌，成为主要的病原弧菌。由于疫苗和免疫增强剂等其他控制方法的局限性，抗生素被认为是对抗细菌性传染病最有效、最灵活的武器，被广泛用于预防或治疗水产养殖中的细菌性疾病。目前，哈维弧菌的耐药形势严峻，耐药指数高达0.60。因此，阐明其致病机制和耐药机制并制备相关疫苗，进行免疫防控迫在眉睫。

致病机制和耐药机制研究以及减毒活疫苗等的研发通常涉及基因敲除的基因工程操作。但是，传统的使用大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细菌携带外源基因，并与受体菌接合转移实现外源载体进入受体细胞内，并进一步发生同源重组进行基因敲除的方法，在哈维弧菌中因接合转移成功率极低，甚至不能成功转移，而受到阻碍，这限制了该菌的遗传学研究。

基于以上问题，该专利发明了构建高接合转移效率哈维弧菌的方法，并提供高接合转移效率的哈维弧菌菌株，这对未来进行哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制和耐药机制等，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供敲除限制性内切酶BsuBI-R基因在提高菌株接合转移效率中的应用。

优选，所述的菌株是哈维弧菌，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp所示。

本发明的第二个目的是提供一种高接合转移效率哈维弧菌，其是将哈维弧菌的限制性内切酶BsuBI-R基因敲除，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp。

本发明的第三个目的是提供一种高接合转移效率哈维弧菌的构建方法，其是将哈维弧菌的限制性内切酶BsuBI-R基因敲除，获得高接合转移效率哈维弧菌，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp。

优选，包括以下步骤：

步骤一、对哈维弧菌基因组上的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R设计基因敲除引物；

步骤二、以哈维弧菌为出发菌株，敲除所述的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R，相应获得基因缺失菌株V.harveyi 345-ΔBsuBI-R，即为高接合转移效率的哈维弧菌。

优选地，步骤一中所述基因敲除引物为：上游同源臂扩增引物：ataagcttgatatcgaattcCTAGAAGTGACAATAACCGTGTC和gagaagaacgACACTCCAATCGTCAGTTGG，下游同源臂扩增引物attggagtgtCGTTCTTCTCCTAGAATTAAATAACAAAG和taattggtaacgaatcagacACAAGATGTTTGCAGATCTTAGA所示。

优选地，步骤二中，所述的敲除所述的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R具体包括如下步骤：

(1)PCR扩增所述BsuBI-R基因上下游同源臂和线性化自杀质粒；