[发明专利]一株高接合转移效率哈维弧菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.敲除限制性内切酶BsuBI-R基因在提高菌株接合转移效率中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的菌株是哈维弧菌，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp所示。

3.一种高接合转移效率哈维弧菌，其特征在于，是将哈维弧菌的限制性内切酶BsuBI-R基因敲除，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp。

4.一种高接合转移效率哈维弧菌的构建方法，其特征在于，是将哈维弧菌的限制性内切酶BsuBI-R基因敲除，获得高接合转移效率哈维弧菌，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、对哈维弧菌基因组上的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R设计基因敲除引物；

步骤二、以哈维弧菌为出发菌株，敲除所述的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R，相应获得基因缺失菌株V.harveyi345-ΔBsuBI-R，即为高接合转移效率的哈维弧菌。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤一中所述基因敲除引物为：上游同源臂扩增引物：ataagcttgatatcgaattcCTAGAAGTGACAATAACCGTGTC和gagaagaacgACACTCCAATCGTCAGTTGG，下游同源臂扩增引物attggagtgtCGTTCTTCTCCTAGAATTAAATAACAAAG和taattggtaacgaatcagacACAAGATGTTTGCAGATCTTAGA所示。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述的敲除所述的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R具体包括如下步骤：

(1)PCR扩增所述BsuBI-R基因上下游同源臂和线性化自杀质粒；

(2)通过等温组装上下游同源臂和线性化自杀质粒，得到重组质粒，将所述的重组质粒先后转化入中间宿主E.coliGEB802和供体菌E.coliGEB883，并通过PCR鉴定；

(3)供体菌E.coliGEB883培养至对数早期，受体菌哈维弧菌345培养至对数早期；

(4)对数早期受体菌哈维弧菌345于40℃热击处理30min，并与对数早期供体菌E.coliGEB883进行接合转移实验；

(5)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、鉴定，即得BsuBI-R基因缺失的菌株，即为高接合转移效率的哈维弧菌。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述自杀质粒为pSW7848。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的单交换克隆子的筛选具体指通过含34μg/mL氯霉素和0.2％D-葡萄糖的平板筛选；步骤(5)中，所述的双交换克隆子的筛选具体指通过含0.2％L-阿拉伯糖的平板筛选；步骤(5)中，所述鉴定具体指设计通过引物对：CATAGGTTACATTGTGGGATCTGTTAG和GACATGCAATAGCATCTAGCTAGC进行PCR鉴定。

10.权利要求3所述的高接合转移效率哈维弧菌作为基因工程菌在基因敲除方面的应用。