[发明专利]一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂、方法以及应用

说明书

本发明公开一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂、方法以及应用，属于基因工程技术领域。为了提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率以及多基因编辑的效率的技术问题。本发明公开一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂，所述诱导剂为Nedisertib或/和ssODN‑M。该方法对单个基因或同时对多个基因提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂、方法以及应用。

背景技术

猪作为一种常见的大型实验动物，用于许多生物医学研究，特别是在转化研究领域。猪适合用于生物医学研究，因为(1)猪的的繁殖力高，很容易繁殖后代，(2)猪的生理结构、器官大小、基因组都与人具有极大的相似性，是一种非常适合用来模拟人生理特征和表型的模式动物，可以作为医学模型来研究疾病的发生与治疗，(3)猪具有经济价值，对于农业生产和遗传育种都有一定的价值。生产基因修饰猪模型可以快速的构建疾病模型猪和遗传育种优良的品质猪，这对于医学研究和农业发展都有重要的实际意义。

1985年，研究人员首次将DNA显微注射到受精卵中并产生出世界上第一头转基因猪，自此以后生产基因修饰猪的方法也随着基因工程技术的进步不断革新。猪的基因修饰技术通常涉及到外源基因的引入，包括使用逆转录病毒和慢病毒的策略，以及使用精子作为外源基因载体的方法。利用胚胎干细胞(ESCs)是生产转基因动物的理想策略，利用胚胎干细胞技术创造基因敲除小鼠的研究已被证实，然而在猪上还缺乏能够进行生殖系传递的ES细胞。体细胞核移植(SCNT)技术是猪基因工程学史上的重大突破，SCNT使用转基因(通过基因转移或基因敲除)核供体细胞来产生具有基因修饰的转基因个体。然而，通过同源重组对体细胞进行基因打靶操作复杂，效率极低。在基因组编辑技术被开发出来之前，基因敲除猪的生成都是相对罕见的。

随着基因编辑技术的快速发展，构建基因编辑猪模型的难度也大大降低。目前常用两种方法来生产基因编辑猪，细胞质注射和SCNT的方法。细胞质注射方法通常用于啮齿类动物，细胞质注射虽然操作简单，但是否成功获得了特定的基因型，只有在个体产生后才能显现出来。使用胞质注射的另一个实际问题是容易产生嵌合体个体，这种嵌合体个体混杂了突变细胞和无突变细胞，导致表型的不稳定表达。此外，嵌合体个体可以产生多种突变类型的生殖细胞。在下一代中选择具有所需基因型的个体需要大量的时间、劳动力和费用，这在生产妊娠期较长的大型动物时尤其成问题。相比之下，SCNT方法通过在核供体细胞中进行基因修饰，可以可靠地仅生产具有特定基因型的个体，大多数研究小组仍然采用SCNT生产基因修饰猪。

CRISPR/Cas9系统作为目前使用最为广泛的基因编辑技术，借助CRISPR基因编辑技术生产基因编辑猪模型的相关报道也越来越多。在农业上，借助基因编辑可以在短时间内培育出具有经济性状或具抗病性的农作物家畜品种，如重构猪UCP1基因产生的瘦肉型猪。2014年Whitworth,K.M.等利用CRISPR/Cas9成功将猪CD163(Cluster ofdifferentiation 163)基因敲除，CD163蛋白是猪蓝耳病病毒的受体，通过敲除CD163获得了免疫猪蓝耳病病毒感染的基因编辑猪模型。在医学研究上，2014年，Sato,M.等人对猪的GGTA1基因(α-1,3半乳糖苷转移酶)进行敲除，该基因敲除猪表现为超急性免疫排斥功能受损，能够有效降低异种器官移植过程中的免疫排斥反应，这对异种器官移植具有重要意义。2018年Yan等人利用CRISPR生产了HTT基因敲入的亨廷顿舞蹈症猪疾病模型。CRISPR技术在猪上的应用极大的加快了以猪模型为基础的的医学研究和农业育种进程。

CRISPR系统最初在原核生物中作为一种免疫外源核酸的防御机制被发现，经人工改造后，成为了广泛应用于各物种基因组编辑的强有力工具。CRISPR介导的基因编辑技术极大的推动了生物学基础研究，医学研究及农业育种的发展。然而CRISPR/Cas9系统的编辑能力仍在许多方面存在缺陷，例如CRISPR/Cas9系统介导的精确基因编辑效率较低，这主要是由于精确基因编辑依赖的同源重组修复(HDR)效率较低。