[发明专利]一种用于大肠杆菌自裂解的裂解模块、系统及其应用

说明书

本发明涉及一种用于大肠杆菌自裂解的裂解模块、系统及其应用，涉及大肠杆菌自裂解领域，所述裂解模块为SP‑lysozyme‑SsrA，所述SP为编码信号肽的核苷酸序列，所述SsrA降解标签的氨基酸序列为SEQ ID NO：8，所述lysozyme的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述SP融合在lysozyme的N‑端，所述SsrA融合在lysozyme的C‑端。通过采用更简单、高效的方式协助细胞质中的溶菌酶(lysozyme)进入周质空间，降低裂解模块数量以减少对宿主细胞造成的代谢负担；同时解决了裂解模块泄漏表达的问题，降低细胞毒性，提高了宿主细胞的生物量和目的蛋白产量。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌自裂解领域，具体涉及一种用于大肠杆菌自裂解的裂解模块、系统及其应用。

背景技术

利用细菌、酵母、动物细胞等表达系统生产高附加值重组产物已成为生物技术领域的常规策略，其中大肠杆菌系统因其简便性、经济性和高产性一直是最受欢迎的表达系统。大肠杆菌表达系统中回收胞内目的蛋白的第一步是细胞裂解。传统的机械方法，如超声处理和高压匀浆通常能够取得理想的裂解效果，但需要额外的设备增加成本，另外破碎过程产生的强烈的剪切力和高温高压容易造成目的蛋白变性和活性丧失等问题。另一方面，机械的破碎方法无法满足高通量筛选技术中样品在微孔板中裂解的需求。

大肠杆菌自裂解系统完全弥补了机械破碎方法的不足，可以实现胞内蛋白原位、温和、经济的释放，不仅规避了昂贵细胞破碎仪的使用，同时也可以在裂解过程中维持目的蛋白的高活性状态。因此，该系统是一种很有前景的工具，可用于在工业上大规模回收目标产物，也可以应用于蛋白酶的定向进化和高通量筛选。

大肠杆菌自裂解过程的实现主要依赖溶菌酶(lysozyme)去切割周质空间的肽聚糖层，该过程导致大肠杆菌细胞骨架坍塌而造成细胞裂解。由于溶菌酶lysozyme表达后存在于细胞质中，其自身无法抵达周质空间的肽聚糖层，所以噬菌体穿孔蛋白和一些具有膜破坏效应的蛋白如磷脂酶、D-氨基酸氧化酶常与lysozyme共表达来协助其进入到周质空间。然而，这种多酶协调的裂解模块泄漏表达会给宿主细胞带来更多的细胞毒性，同时显著的代谢负荷和有限的代谢资源会导致靶蛋白的产量较低。因此，本发明需要聚焦于两个问题去建立更加严谨、高效的大肠杆菌自裂解系统的新方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于大肠杆菌自裂解的裂解模块、系统及其应用。本发明的目的是采用更简单、高效的方式协助细胞质中的溶菌酶(lysozyme)进入周质空间，降低裂解模块数量以减少对宿主细胞造成的代谢负担；同时解决了裂解模块泄漏表达的问题，降低细胞毒性，提高了宿主细胞的生物量和目的蛋白产量。

本发明解决上述技术问题，第一个目的是提供了：一种用于大肠杆菌自裂解的裂解模块，所述裂解模块为SP-lysozyme-SsrA，所述SP为编码信号肽的核苷酸序列，所述SsrA为编码SsrA降解标签的核苷酸序列，所述SsrA降解标签的氨基酸序列为SEQ ID NO：8，所述lysozyme为编码溶菌酶的核苷酸序列，所述lysozyme的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述SP融合在lysozyme的N-端，所述SsrA融合在lysozyme的C-端。

所述SP也可以通过亲水linker融合在lysozyme的N-端，例如通过GS linker(Gly-Ser)融合在lysozyme的N-端，添加亲水linker序列是为了防止SP信号肽被包埋在lysozyme结构内部而影响分泌效果。亲水linker的长度应10AA，以免影响lysozyme的裂解活性。

本发明的有益效果是：本发明首次将SsrA降解标签应用到大肠杆菌自裂解系统中来解决裂解模块泄漏表达的难题。与现有的系统相比，应用SsrA降解标签的系统会比其他系统严谨性更高、毒性更低，从而能在相同的时间内获得更快的生长速度并积累更多目的蛋白。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。