[发明专利]脱细胞人羊膜的制备方法

说明书

本发明公开了一种脱细胞人羊膜的制备方法，包括以下步骤：(1)取新鲜的人羊膜，浸泡于初步消毒溶液中；(2)依次用无菌水、次氯酸钠溶液、无菌水清洗；(3)浸入冻存溶液中，捞出，反复冻融两次；(4)置于TritonX‑100溶液中，摇床孵育，初步去除细胞；然后用PBS溶液震荡清洗羊膜；(5)置于脂肪酶溶液中，摇床孵育，以充分去除上皮细胞及其他杂质，然后用PBS溶液震荡清洗羊膜；(6)将羊膜平铺在硝酸纤维膜上，冷冻；(7)冷冻干燥至含水量为5％～7％。本发明的脱细胞人羊膜的制备方法，不使用物理方法刮擦羊膜，保证了原有的重要细胞因子含量，维持了组织学结构，无细胞毒性，DNA含量符合脱细胞标准。

技术领域

本发明涉及一种脱细胞人羊膜的制备方法，属于生物材料处理技术领域。

背景技术

人羊膜是一张半透明薄膜，位于胎盘最内层，总厚度0.02～0.5mm，结构共五层，包括上皮细胞层、基底膜层、致密层、成纤维细胞层、海绵层。羊膜没有神经、淋巴管和血管，具有低免疫原性，能抑制白细胞与细菌浸润，抑制相应蛋白酶，具有多种因子，这些特性使羊膜被多个临床科室应用。然而，新鲜羊膜在安全性、存储等方面仍具有挑战，研发人员一直在研究稳定的脱细胞方法。脱细胞化过程是去除所有的细胞，降低免疫原性和炎症的同时保留基底膜和细胞外基质(ECM)的主要成分，使脱细胞羊膜成为一种新型、可靠的生物材料，以用作各种器官和组织修复的支架。

成人皮肤和组织受损后，会进行自我修复，但由于缺乏维持正常皮肤弹性的胶原纤维网络及生长因子，愈合后的伤口只能达到其原始组织强度的70％。脱细胞人羊膜含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、血管EGF(VEGF)、转化生长因子(TGFs)、神经生长因子(NGF)和许多已知的趋化因子，以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原、粘连蛋白、层粘连蛋白，这些生长因子及蛋白可以发挥上皮化作用，有利于伤口的愈合，因此脱细胞人羊膜对急性和慢性伤口的愈合都很重要，也能提高患处皮肤移植成功率。

中国发明专利CN 105797212 A公开了一种用于皮肤难愈合创面修复的脱细胞羊膜制备方法及应用，该脱细胞方法涉及到胰蛋白酶与核酸酶，会降解ECM成分和生长因子，导致羊膜结构发生改变，从而影响创伤的修复效果。中国发明专利CN 110946879 A公开了一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜及其制备方法，使用过氧乙酸进行病毒灭活，过氧乙酸性质不稳定，易分解，在稀释时很难控制浓度。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种脱细胞人羊膜的制备方法。本发明的方法不使用物理方法刮擦羊膜，结合低温和表面活性剂方法，优化低温冷冻操作，减少冰晶形成，保护羊膜结构和基质完整。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种脱细胞人羊膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜的人羊膜，浸泡于初步消毒溶液中(浸泡时间20分钟)，对羊膜进行初步消毒，并抑制细菌生长；

所述初步消毒溶液为含有50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素的PBS溶液；

(2)取出羊膜，用无菌水清洗(4次，每次10分钟)，再用浓度为0.05％的次氯酸钠溶液清洗10分钟(次氯酸钠灭活病毒，对羊膜无损伤)，再用无菌水清洗(4次，每次10分钟)；

进一步地，清洗过程中进行摇床震荡，羊膜会随晃动而充分展开，清洗效果更佳；

(3)将清洗后的羊膜浸入冻存溶液中，捞出置于滤纸上，充分展开，再覆盖一层滤纸，置于-80℃环境下冻存1小时，然后置于37℃环境下融化0.5小时，再置于-80℃环境下冻存1小时，然后置于37℃环境下融化0.5小时(即反复冻融2次)，以破坏细胞壁，且冻融次数少，甘油可以减少冰晶损伤，滤纸能吸走部分水分；