[发明专利]构建PAH基因突变的苯丙酮尿症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用

说明书

本发明公开了构建PAH基因突变的苯丙酮尿症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了包括SEQ ID NO：16所示PAH‑gRNA1、SEQ ID NO：17所示PAH‑gRNA4和NCN蛋白的试剂盒。本发明还提供了制备重组细胞的方法：将PAH‑gRNA1、PAH‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。所述重组细胞为PAH基因发生突变的重组细胞。试剂盒的用途为：制备重组细胞；制备苯丙酮尿症模型猪；制备苯丙酮尿症细胞模型或苯丙酮尿症组织模型或苯丙酮尿症器官模型。本发明对于苯丙酮尿症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于基因编辑技术领域，更具体涉及构建PAH基因突变的苯丙酮尿症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。

背景技术

苯丙酮尿症是一种常染色体隐性遗传的L-苯丙氨酸代谢病，其是由于PAH基因的突变导致部分或完全缺乏苯丙氨酸羟化酶的活性，使得苯丙氨酸无法正常转化为酪氨酸。这种代谢错误不仅会导致苯丙氨酸及其次级代谢产物酮酸在体内堆积，还会造成血液和大脑中酪氨酸浓度的降低，导致神经退行性疾病及智力缺陷等症状。在全球范围内，苯丙酮尿症的发病率约为1：8000。目前，苯丙酮尿症患者一旦确诊，需要终生接受监测和治疗，以减缓相关神经退行性疾病的发展。

研究苯丙酮尿症的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

发明内容

本发明的目的是提供构建PAH基因突变的苯丙酮尿症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。

本发明提供了一种试剂盒，包括PAH-gRNA1、PAH-gRNA4和NCN蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒，包括PAH-gRNA1、PAH-gRNA4和PRONCN蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒，包括PAH-gRNA1、PAH-gRNA4和特异质粒。

以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。

本发明提供了PAH-gRNA1、PAH-gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。

本发明还提供了PAH-gRNA1、PAH-gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。

本发明还提供了PAH-gRNA1、PAH-gRNA4和特异质粒在制备试剂盒中的应用。

以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备苯丙酮尿症模型猪；(c)制备苯丙酮尿症细胞模型或苯丙酮尿症组织模型或苯丙酮尿症器官模型。

本发明提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将PAH-gRNA1、PAH-gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。

所述共转染具体采用电击转染的方式。

电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。

所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与NeonTM transfection system电转仪。