[发明专利]一种超低频基因突变检测方法

权利要求书

1.一种超低频基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)探针与引物设计：根据样品目标捕获区域设计探针和引物，使探针比引物更倾向于与样品目标捕获区域结合；所设计的探针能与样品目标捕获区域完全互补，而与含有突变位点的序列在突变位点不能完全互补；

(2)杂交：将步骤(1)中设计的探针与样品DNA进行杂交形成双链DNA；

(3)首轮突变富集：采用特异性DNA内切酶消化杂交后产生的双链DNA；

(4)预扩增：采用步骤(1)的探针与引物竞争性与步骤(3)消化后的产物进行PCR扩增，使探针与引物竞争性地与消化产物杂交，进一步富集含有突变位点的DNA片段；

(5)接头连接；将测序接头连接到所述预扩增产物两端；

(6)进行上机测序和数据分析。

2.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述探针序列5’端与引物序列3’端有4-12个碱基互补配对。

3.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述探针序列的3’端封闭。

4.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述使探针比引物更倾向于与样品目标捕获区域结合通过调整探针与引物序列重叠区域、引物未重叠部分、以及探针未重叠部分的自由能实现。

5.根据权利要求4所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述引物未重叠部分、探针与引物序列重叠区域、以及探针未重叠部分的自由能分别为～-7千卡/摩尔、～-4.5千卡/摩尔、以及～-10千卡/摩尔。

6.根据权利要求1-5任一项所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述特异性DNA内切酶采用双链特异性核酸酶，能消化完全互补的双链DNA，而保留不能完全互补的双链DNA。

7.根据权利要求6所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述PCR扩增体系为，反应溶液：1μL消化后的产物杂交混合液，1X缓冲液，20-100nM探针序列和引物各0.3μM，0.05U/μL DNA聚合酶，1.5mM MgCl₂，以及四种dNTPs各200μM；

反应程序：98℃预变性30s；扩增22个循环：98℃变性10s，T_m退火5min，72℃延伸2min；4℃保持。

8.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述接头连接中的接头为通用测序接头。

9.根据权利要求1所述一种超低频基因突变检测方法，其特征在于：所述数据分析的流程为数据清洗、质量控制、比对到参考基因组、突变识别与注释。