[发明专利]一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法

说明书

本发明提供一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)培养瓶的包被；(2)外周血单个核细胞的准备；(3)T细胞扩增。本发明提出了一种新的T细胞扩增方法，通过培养基中添加烟酰胺扩增获得T细胞，研究不同浓度的NAM对扩增的T细胞中Tsubgt;CM/subgt;比例、细胞扩增倍数和细胞抗凋亡能力的影响，得到扩增培养基中加入10mM NAM是扩增T细胞的最佳剂量。该方法所获得的T细胞数量多，Tsubgt;CM/subgt;比例高，抗凋亡能力强，体内增殖能力强，为T细胞的临床治疗应用提供基础。

技术领域

本发明涉及一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，属于细胞技术领域。

背景技术

近年来，过继性免疫细胞治疗特别是嵌合型抗原受体细胞(Chimeric antigenreceptor Tcell，CAR-T)、T细胞受体嵌合型T细胞(Chimeric T cell receptor T cell，TCR-T)和肿瘤浸润T细胞(Tumor-Infiltrating T Cells，TILs)在肿瘤治疗中疗效显著成为研究的热点。研究发现，过继T细胞在体内的生存和扩增能力与治疗效果高度相关，T细胞在体内的生存和扩增能力又与T细胞的分化程度呈负相关，T细胞分化程度越高其在体内增殖和生存能力越低。

T细胞的分化遵循从幼稚T细胞(Naive T cell，CD3⁺CD45RA⁺CCR7⁺)向干细胞样记忆性T细胞(T_SCM，CD3⁺CD45RA⁺CCR7⁺)、中央记忆性T细胞(T_CM，CD3⁺CD45RO⁺CCR7⁺)、效应记忆性T细胞(T_EM，CD3⁺CD45RO⁺CCR7^-)和效应T细胞(T_E，CD3⁺CD45RO^-CCR7^-)的渐进分化过程。在临床实践中，T细胞都需要经过体外大量扩增以满足治疗剂量。

然而，虽然已有多种T细胞体外扩增方法，但这些T细胞扩增方法，往往会导致T细胞终末分化为效应T细胞，回输患者体内后细胞增殖和扩增能力低下，严重影响过继性T细胞治疗的疗效。因此，开发一种能够减少T细胞终末分化的新型快速扩增方法，使T细胞分化为T_CM，保持T细胞在体内的生存能力，提高T细胞治疗的效果，具有重要的临床应用意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法。该方法所获得的T细胞数量多，T_CM比例高，抗凋亡能力强，体内增殖能力强，为T细胞的临床治疗应用提供基础。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)培养瓶的包被：向培养瓶中加入抗体包被液，于4℃静止过夜，随后弃去抗体包被液，用PBS缓冲液冲洗2～3遍，加入10mL的PBS缓冲液，置于4℃保存，备用；

(2)外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血，离心分离得到血浆，加等体积生理盐水重悬细胞；用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，随后用PBS缓冲液冲洗2～3遍，进行细胞计数，备用；

(3)T细胞扩增：