[发明专利]一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法

权利要求书

1.一种诱导扩增中央记忆性 T 细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）培养瓶的包被：向培养瓶中加入抗体包被液，于 4℃静止过夜，随后弃去抗体包被液，用 PBS 缓冲液冲洗 2~3 遍，加入 10mL 的 PBS 缓冲液，置于 4℃保存，备用；

（2）外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血，离心分离得到血浆，加等体积生理盐水重悬细胞；用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，随后用PBS缓冲液冲洗 2~3 遍，进行细胞计数，备用；

（3）T 细胞扩增：

使用 T 细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞，重悬后细胞悬液总体积不超过 50mL；将细胞悬液加入步骤（1）包被后的培养瓶中，置于 37℃、5% v/v CO₂ 静止培养，保持细胞密度为 0.5×10⁶ ~2.5×10⁶ cells/mL；培养第 7 天或细胞体积到达 450~550 mL 后，转入细胞培养袋，继续培养，培养第 14 天或细胞体积达到 2.5L 时，收获细胞；

所述 T 细胞扩增培养基中，含有 1% v/v 的自体血浆、终浓度 10ng/mL 的 IL7、终浓度 10ng/mL 的 IL15 和终浓度10mM 的 NAM；

所述抗体包被液为 pH 值 8.0 的 PBS 缓冲液，其中含有 5μg/mL 抗 CD3 活化性抗体和 5μg/mL 抗 CD28 活化性抗体。

2.如权利要求 1 所述的培养方法，其特征在于，所述自体血浆是通过以下方法得到的：收集患者自体血浆，于 56℃孵育 30min，随后 4℃静止 1 小时，使用 4000×g 离心力离心 20min，去除杂质，置于 4℃保存，备用。

3.如权利要求 1 所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）T 细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞后，细胞密度为1×10⁶ ~2.5×10⁶ cells/mL。