[发明专利]基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开一种基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用，具体涉及到通过RNAi干扰技术干扰核盘菌中OAH基因的表达、克隆、草酸的合成与技术应用。本发明从核盘菌中分离克隆得到核盘菌关键致病蛋白OAH核苷酸序列，将其作为干涉片段，靶向沉默核盘菌OAH基因表达，该序列如SEQ ID NO：1所示。本发明对RNAi干扰核盘菌OAH基因的功能进行了验证。通过基因工程技术在沉默核盘菌OAH基因表达，影响草酸合成积累，使转基因油菜叶片及茎秆接种菌核病后病斑面积减少，提高转基因油菜对核盘菌的抗性，对增强甘蓝型油菜对菌核病抗性具有重要的应用前景。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用。

背景技术

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是制约油菜生产的最主要病害。核盘菌治病范围十分广泛，可寄生75个科278个科属400多种植物，每年在世界范围内造成巨大的经济损失(Boland G.，Hall R.Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum[J].CanJ Plant Pathol，1994,16:93-108)。核盘菌引起的菌核病不仅会导致油菜减产，还会使油菜籽的品质下降(张晓娟，张羽,胡胜武.油菜菌核病抗性机理及抗病遗传育种研究进展,分子植物育种，2016,14(3):704-711)。目前防治核盘菌的方法主要依靠化学防治法和抗病品种选育，但是化学防治方法存在较多的不足，比如防治效果不高，花期喷药困难，容易造成农药残留，易造成环境污染，时间一长，容易造成核盘菌产生耐药性，从而导致杀菌剂防治效果下降(秦虎强,陈芳颖,付鼎程.油菜菌核病菌对10种杀菌剂的敏感性及不同药剂田间防效[J].西北农林科技大学学报自然科学版,2011,39(7):117-122)。由此，常规防治核盘菌的方法不足以满足油菜产量需求，利用分子育种技术培育抗核盘菌品种油菜成为提高油菜产量的重要策略。

核盘菌是一种典型的死体营养型植物病原真菌(Hegedus D.D,RimmerS.R.Sclerotinia sclerotiorum:When“to be or not to be”a pathogen[J].FernsMicrobiology Letters,2005,251(2):177-184)。核盘菌致病机理复杂，目前的研究主要认为核盘菌通过分泌植物细胞壁降解酶(Plant cell wall degrading enzymes,PCWDEs)降解寄主细胞壁，分泌草酸(Oxalic acid,OA)来协助其侵染植物,另外一些效应因子(Effector)也参与核盘菌与寄主之间的互作。草酰乙酸水解酶(OAH)是产生草酸的关键性酶(Jarosz Wil kolaz ka A.,Gadd GM.Oxalate production by wood-rotting fungigrowing in toxic metal-amended medium[J].Chemosphere，2003,52(3)：541-547)。在草酸合成的最后一步中，该酶能够将草酰乙酸水解，直接形成草酸(Dutton MV,EvansC.S.Oxalate production by fungi:Its role in pathogenicity and ecology in thesoil environment[J].Canadian Journal of Microbiology,1996,42(9)：881-895)，是真菌中特有的酶。在真菌的草酸代谢研究中，草酰乙酸水解酶也是研究的必要性酶。