[发明专利]一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用

说明书

本发明涉及一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用，所述方法包括：取纳豆激酶发酵液或纳豆激酶粗品溶液依次进行Ⅰ级微滤处理、Ⅱ级超滤处理和Ⅲ级超滤处理，即得纯化的纳豆激酶。本发明所涉及的分离纯化纳豆激酶的方法简单易操作，无需借助大型仪器或设备，也无需使用化学试剂，成本低，整个流程耗时较短；且纯化得到的纳豆激酶能够长期有效保存，具有较高的纯度和酶活力，非常适合于大规模化的工业生产。

技术领域

本发明属于生化分离纯化技术领域，涉及一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用，具体涉及一种利用膜技术高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备具有高酶活的纳豆激酶粉中的应用。

背景技术

纳豆激酶(Nattokinase,NK)是从纳豆发酵中分离出一种具有强纤溶活性的酶。纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成，分子量为27.7kDa。与其他溶栓药物相比，纳豆激酶具有安全性高、作用时间长、溶栓活性好、价格低廉等特点，有望成为未来具有较强市场竞争力的溶栓药物。

纳豆激酶的分离纯化一直是制约其开发应用的关键，因此人们在纳豆激酶的分离纯化上进行了较多的研究。目前常用的分离纯化方法包括离心、膜分离、柱层析、色谱纯化等。

例如CN101979530A公开了一种采用乙醇沉淀粗提、阴阳离子交换树脂层析和HPD-400大孔吸附树脂精制来分离纯化得到纳豆激酶纯品的方法，该发明采用适于工业化生产的柱层析填充材料，代替了常用的昂贵的凝胶等材料，收率可达59％，纯度95％以上，具有收率高、成本低、可以规模化生产的特点。但整个流程耗时较长，操作相对复杂。

例如采用硫酸铵分级沉淀、凝胶柱过滤，虽然取得较好的分离效果，但操作容量有限，生产成本高。通过硫酸铵分级盐析法和PhenylSepharose疏水柱层析进行分离纯化，纯化倍数14.82，回收率为44.03％。但由于硫酸铵沉淀后使得整个酶溶液的离子强度变大，在采用离子交换柱时一般都先要透析脱盐，不然会对后续纯化步骤带来很大干扰，因此往往使得整个流程耗时较长。总之，目前的分离纯化方法都存在工业生产困难和成本高等缺点。

因此，开发一种简单易操作，且纯化后的纳豆激酶易于长期有效保存且具有较高酶活力的纳豆激酶分离纯化方法是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用，具体提供一种利用膜技术高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备具有高酶活的纳豆激酶粉中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种高效分离纯化纳豆激酶的方法，所述方法包括：取纳豆激酶发酵液或纳豆激酶粗品溶液依次进行Ⅰ级微滤处理、Ⅱ级超滤处理和Ⅲ级超滤处理，即得纯化的纳豆激酶。

本发明所涉及的分离纯化纳豆激酶的方法简单易操作，无需借助大型仪器或设备，也无需使用化学试剂，成本低，整个流程耗时较短；且纯化得到的纳豆激酶能够长期有效保存，具有较高的纯度和酶活力，非常适合于大规模化的工业生产。

优选地，所述Ⅰ级微滤处理中使用的膜材料包括平板膜、管式膜、卷式膜或中空纤维膜。

优选地，所述Ⅰ级微滤处理中使用的膜材料的材质包括醋酸纤维素、硝酸纤维素、混酯、再生纤维素或聚醚砜中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述Ⅰ级微滤处理中使用的膜材料的孔径为0.1-0.3μm，例如0.1μm、0.12μm、0.15μm、0.18μm、0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.28μm、0.3μm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。