[发明专利]一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用，在将B602L重组蛋白完成序列改造后，将其克隆至真核表达载体，进行真核表达，经过筛选能得到稳定表达B602L重组蛋白的CHO细胞株。利用本发明的构建方法能在1个月内筛选获得表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白的CHO细胞株，并在没有G418筛选压力下，细胞系传至20代，仍可检测到外源重组蛋白，具有试验周期短、成功率高和表达成本低的优点。

技术领域

本发明涉及重组蛋白表达的技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒B602L 重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)引起的一种急性、出血性、烈性猪传染病。世界动物卫生组织(OIE) 将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病和重点防范的外来动 物疫病之一。自2018年8月首次在我国报道以来，已经迅速蔓延至全国各地， 造成巨大经济损失和严重影响社会稳定。目前ASF尚无有效疫苗，针对该病的 预防和控制措施主要靠对感染猪及与其密切接触的猪进行快速诊断和扑杀。

B602L蛋白是一种在ASFV感染晚期表达的非结构蛋白，被认为是帮助衣 壳蛋白p72正确折叠的分子伴侣。研究显示抑制B602L蛋白的表达能够导致p72 蛋白水平下降和衣壳蛋白pE120R的移位，改变病毒的组装过程，使其出现异常 的“拉链状”结构。B602L蛋白已被证实具有良好的抗原性，能刺激机体产生 较高水平的抗体，它在感染后的后期可被家猪和丛林猪的高免抗血清识别，提 示针对其的ELISA可能是区分持续感染病毒动物与免疫动物的有效诊断方法。

目前常见的重组蛋白表达系统主要有大肠杆菌原核表达系统和真核表达系 统，如酵母表达系统、昆虫细胞和哺乳动物细胞系统。原核表达系统具有遗传 背景清楚、培养操作简单、成本低廉，且可以快速大规模地生产目的蛋白等优 点而被广泛应用，但是原核表达的重组蛋白可能出现错误折叠、失活等情况。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种非洲猪瘟病毒 B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，利用基因工程技术通过真核表达 系统构建稳定表达B602L重组蛋白的CHO细胞系以及得到纯度较高的B602L 重组蛋白；本发明的目的之二在于提供一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定 表达细胞系，高产量、免疫原性良好；本发明的目的之三在于提供一种非洲猪 瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的应用，可用于ASFV血清学诊断用抗 原的研究，对于ASFV的诊断和疫苗生产具有重要的意义。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，包括以下 步骤：

1)构建载体：分析非洲猪瘟B602L重组蛋白的基因序列的信号肽和酶切位 点信息，B602L重组蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：1所示；在起始密码子 ATG之前添加如SEQ.ID NO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.ID NO:3 所示的小鼠IgGκ链信号肽序列；再在肽链C端连接组氨酸标签体以融合蛋白 与目的蛋白相连接，完成序列改造后的目的蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：4 所示，将目的蛋白序列克隆至真核表达载体；

2)真核表达：将步骤1)的克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染 到经过培养的CHO细胞，进行培养，收集的上清和细胞，选取一半上清和细胞 进行蛋白检测，另一半进行筛选；

蛋白检测：将上清和细胞采用蛋白质印迹法进行蛋白检测，第一抗体为抗 His标签鼠单克隆抗体，第二抗体为山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶酶标抗体，最 后用显色液避光显色，在凝胶成像仪上拍照，观察着色情况；