[发明专利]一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建载体：分析非洲猪瘟B602L重组蛋白的基因序列的信号肽和酶切位点信息，B602L重组蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：1所示；在起始密码子ATG之前添加如SEQ.IDNO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.ID NO:3所示的小鼠IgGκ链信号肽序列；再在肽链C端连接组氨酸标签体以融合蛋白与目的蛋白相连接，完成序列改造后的目的蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：4所示，将目的蛋白分别克隆至真核表达载体；

2)将步骤1)的克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，进行培养，收集的上清和细胞，选取一半上清和细胞进行蛋白检测，另一半进行筛选；

蛋白检测：将上清和细胞采用蛋白质印迹法进行蛋白检测，第一抗体为抗His标签鼠单克隆抗体，第二抗体为山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶酶标抗体，最后用显色液避光显色，在凝胶成像仪上拍照，观察着色情况；

筛选：将上清和细胞进行润洗，换新培养基进行培养，再加入抗性筛选试剂进行筛选培养，以有限稀释法筛选出若干个单克隆细胞株，经观察及鉴定正确后，扩大培养并冻存CHO细胞；将冻存的细胞复苏，连续传代，检测重组蛋白B602L能否表达。

2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述组氨酸标签体是由6个组氨酸成串的肽段；所述融合蛋白为含有4个四联体的柔性Linker；所述真核表达载体为pCMV-EGFP。

3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2)中，所述CHO细胞的培养步骤为：使用含10％胎牛血清的Ham’s F12-K培养基在细胞瓶中复苏CHO细胞，按照1：3的比例进行传代，直到细胞量(0.2～7)×10⁸个细胞；待CHO细胞汇合度达70～90％时，弃去培养基，使用PBS润洗1～2次，加入0.5～2mL质量浓度为0.25％的EDTA胰酶消化，以(0.5～2)×10⁶个细胞的密度接种6孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养箱培养18～24h。

4.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2)中，将克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，每孔转染DNA量为2～2.5μg，转染前半小时弃去原培养基，换成Opti-MEM无血清培养基，每孔1～2mL，得到脂质体混合物；将培养混合液缓慢加入六孔板中，十字交叉法混匀使脂质体复合物尽量接触到细胞单层，在35～38℃和体积含量为5％的CO₂氛围下孵育6～8h后换成含5％新生胎牛血清的Ham’s F-12K培养，24h后在荧光显微镜下观察；其中，培养混合液是由A液和B液混合而成的；A液是由LTX Reagent 9μL加入150μL Opti-MEM无血清培养基混合而成，B液是质粒DNA 2.5μg，PLUS^TMReagent 3.5μL和175μLOpti-MEM无血清培养基混合而成。

5.一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系，其特征在于，由权利要求1～4任一项所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法制备而成。

6.一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的应用，其特征在于，权利要求5所述的B602L重组蛋白稳定表达细胞系用于ASFV血清学诊断用抗原。