[发明专利]抗MERS-CoV单克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开了抗MERS‑CoV的单克隆抗体及其制备方法于应用，将MERS‑CoV病毒的s蛋白的部分片段作为免疫原免疫小鼠，通过细胞融合和经过杂交瘤细胞的筛选，初步获得具有较高效价及敏感性的单克隆抗体细胞株。通过棋盘法筛选能够实现最佳配对的单克隆抗体，并对获得的最佳配对抗体进行测序列测定，进一步获得了抗体的重链以及轻链可变区序列。建立一种基于酶联免疫反应(ELISA)的双抗体夹心检测方法用于检测MERS‑CoV。采用所述配对抗体建立的双抗夹心法可以将MERS‑CoV感染者与SARS感染者以及正常阴性血清区分，并且对于临床样本的检测具有较高的符合率。采用本发明制备的单克隆抗体，可以应用于血清样本中MERS‑CoV的检测，以辅助MERS的诊断和预防，具有特异性强、灵敏度高、准确性好等优点。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种抗MERS-CoV单克隆抗体及其应用，以及基于所述单克隆抗体建立的ELISA检测方法。

背景技术

中东呼吸综合征(MERS)是由中东呼吸综合症冠状病毒(MERS corona virus，MERS－CoV)感染引起的一种急发传染性呼吸系统疾病，2012年最早在约旦和沙特发现。

MERS-CoV是一种人兽共患病病毒，单峰骆驼是主要的动物宿主和传播给人类的主要来源。该病毒在单峰骆驼中不会引起重大疾病，但通过无保护措施的鼻、眼分泌物、粪便以及牛奶和尿液与该病毒接触，已多次传播给人类。这种病毒也可能存在于受感染动物的器官和肉中。这种人兽共患病最常发生在阿拉伯半岛国家；目前在非洲、中东和南亚大部分地区的单峰骆驼体内也都发现了这种病毒。

患者主要表现为发热、咳嗽和气短，肺炎常见，偶见腹泻等胃肠炎症状，严重者可发展为肾衰竭后死亡。该病的潜伏期为2至14天，典型表现为急性呼吸道感染，起病急，高热(39℃～40℃)，可伴有畏寒、寒战、咳嗽、胸痛、头痛、全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等症状。目前尚无可用的疫苗和特异性治疗方法，主要采用对症治疗和支持性疗法。虽然该病最初发生在中东地区，但随着贸易、旅游、宗教等的活动的开展，逐渐蔓延到欧洲、非洲、亚洲和北美洲等27个国家。

MERS-CoV的形态结构与分类学冠状病毒科下分α、β、γ和δ4个属，病原学调查确认病原体为一种新的冠状病毒，命名为MERS冠状病毒(MERS-CoV)。前2个属感染人及其他哺乳动物等，后2个属主要感染禽类等脊椎动物。冠状病毒形态结构在电镜下大同小异，多表现为日冕状或皇冠状，多为圆形或椭圆形，表面呈突起状，大的突起主要是刺突蛋白，小的有膜成分在内。

MERS-CoV是单股正链RNA病毒。全基因组一般超过30000个核苷酸，不同株间略有差别，基因组分析分为A、B两亚群，但A亚群只有少数株数，主要都在B亚群。

全基因组编码16种非结构蛋白和4种主要结构蛋白。其中以三聚体形式锚定在囊膜上的刺突糖蛋白(Spike，S)是免疫原性最强的结构蛋白，在病毒吸附，决定病毒毒力和组织嗜性，以及诱导保护性免疫等方面发挥重要作用。S蛋白全长共含有1353个氨基酸，由膜外N端的S1亚基和近膜端的S2亚基组成。研究表明，S1亚基能与宿主细胞表面的DPP4受体结合进而介导病毒进入宿主细胞。MERS-CoV的4个结构蛋白S、M、E、N中，以S蛋白最为重要。S蛋白以三聚体形式存在，以机体的二肽酶(DPP4；又称为CD26)为受体进入细胞，开始进行病毒的生命循环。DPP4主要存在于多种哺乳动物的肾、小肠、肝和前列腺等脏器的上皮细胞表面，在单峰骆驼中，DPP4存在于上呼吸道上皮细胞表面，而在人类中，DPP4则多在肺泡表面表达。S蛋白在进入DPP4前，裂解成S1和S2两个亚基，S1与DPP4的受体结合域(RBD)结合，此后S2细胞与MERS-CoV膜融合，促使病毒核酸进入细胞。