[发明专利]一种无血清培养基及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用

说明书

本发明公开了一种无血清培养基，包括以下重量份原料：1份DMEM培养基、1份Ham’sF‑12培养基和1份RPMI1640培养基，该无血清培养基还包括以下原料：牛血清白蛋白50μg/ml、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白20μg/ml、乙醇胺5μg/ml、亚硒酸钠5ng/ml、水解小麦谷蛋白0.15g/L、大豆水解蛋白0.15g/L、谷氨酰胺2mmol/L和氯化胆碱3mg/L，一种由上述制备得到的无血清培养基应用于杂交瘤细胞体外培养中；本发明通过balb/c小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合来源的杂交瘤细胞在本发明无血清培养基中可无限传代增殖。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种无血清培养基及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用。

背景技术

单克隆抗体在体外诊断和疾病治疗等方面具有非常广泛的应用，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点，目前单克隆抗体的单克隆抗体的制备主要采用体内法，将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长，并产生腹水，因而可得到大量的且抗体浓度很高腹水单抗，但腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括IgG)和脂类物质等，在很多情况下必须要提纯后才能使用，还有动物病毒污染的危险，另外由于小鼠个体差异较大，导致产品批间差较大。因此在无/低血清条件下的杂交瘤细胞的体外大量培养成为当前研究的主要方向；

现阶段杂交瘤细胞体外培养生产单克隆抗体与体内诱生腹水法生产单抗相比产量低，市售无血清培养基价格较高产量低，本发明的培养基通过调整配方，优化体外培养工艺方案使杂交瘤体外培养稳定高浓度表达。

发明内容

本发明的目的就在于解决上述背景技术的问题，而提出一种无血清培养基及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种无血清培养基，包括以下重量份原料：1份DMEM培养基、1份Ham’sF-12培养基和1份RPMI1640培养基，该无血清培养基还包括以下原料：牛血清白蛋白50μg/ml、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白20μg/ml、乙醇胺5μg/ml、亚硒酸钠5ng/ml、水解小麦谷蛋白0.15g/L、大豆水解蛋白0.15g/L、谷氨酰胺2mmol/L和氯化胆碱3mg/L。

作为本发明进一步的方案：基于无血清培养基杂交瘤细胞体外培养方法，包括以下步骤：

步骤1：利用特异性抗原免疫balb/c小鼠，ELISA检测免疫血清效价超过1/100000后，分离小鼠的脾脏细胞，将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，利用HAT进行选择性培养，利用ELISA方法筛选出特异性阳性杂交瘤细胞株，并将阳性克隆杂交瘤细胞株进行克隆化培养获得单克隆杂交瘤细胞株；

步骤2：按照上述原料制备无血清培养基；

步骤3：将获得的单克隆杂交瘤细胞株进行无血清驯化，选择对数生长期，活率大于90％活细胞，调整细胞密度密度达到1×10⁶个/mL，利用上步配制的无血清培养基进行直驯化；

步骤4：选择上步驯化成功的处于对数生长期，活率大于90％活细胞进行传代测试，调整细胞密度密度1×10⁶个/mL每天更换新无血清培养基进行传代培养；

步骤5：选择驯化成功的处于对数生长期，活率大于90％活细胞进行测定培养基生长曲线，调整细胞密度1×10⁶个/mL更换全新配制的无血清培养基，培养体积20ml，在转速130rpm摇床培养，每天统计细胞密度及活率直至细胞活率降至10％以下，获得无血清培养基最大细胞培养密度。

作为本发明进一步的方案：驯化成功的标准：每2-3天，活细胞密度可达2×106个/mL，细胞活率在90％以上，细胞的比生长速率与驯化前一致。