[发明专利]基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方法

说明书

一种基于CRISPR技术制备高产抗体兔的方法，属于生物技术领域。本发明的目的是为开发兔单克隆抗体，采用CRISPR技术创建一种可以制备高产抗体兔的方法。本发明步骤是：获得足够数量兔受精卵，胚胎显微注射，兔基因型鉴定。本发明为开发兔单克隆抗体提供一种手段，促进抗体制备技术将在诊断、药效学及临床应用中发挥前所未有的重大作用，引领新型治疗性抗体研究的崭新时代。

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

由于小鼠免疫系统不能识别某些免疫原，尤其是鼠源性的免疫原，而兔能对外源蛋白质产生强烈的免疫反应，并具有高的亲和性，在众多免疫学实验中兔多克隆抗体得到广泛应用。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术已为高效率基因编辑开辟了一条全新的思路，极大的推动了基因修饰动物的发展，并成功应用于斑马鱼、小鼠、大鼠、兔、猪、猴子等多个物种。

发明内容

本发明的目的是为开发兔单克隆抗体，采用CRISPR技术创建一种可以制备高产抗体兔的方法。

本发明步骤是：

步骤1、获得足够数量兔受精卵：选用雌性新西兰大白兔，在发情期内经肌肉注射促卵泡激素50 IU，以促进卵泡发育成熟，每12小时注射一次，连续注射3天，最后一次注射后，与公兔进行交配，将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100 IU人绒毛膜促性腺激素，在注射18-20h后，取出卵巢和输卵管放于培养皿中，使用冲卵液DPBS-BSA冲出受精胚胎，将胚胎移入培养液EBSS中，置于38.5℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育待用；

步骤2、胚胎显微注射：将体外合成的50ng/UL 的IGHG-sgRNA、单链DNA和200ng/UL的 Cas9mRNA，离心后混合，吸出3μL至注射针中，进行胚胎细胞核注射，注射后的30-50枚受精卵移植到同期发情的受体母兔输卵管中，对代孕母兔提供充足的饲料和饮水，保持干净饲养环境，规范化饲养，妊娠至20天后，转至产房饲养至预产期；

步骤3、兔基因型鉴定：提取组织的DNA，进行PCR及测序，确定基因型；

PCR 引物：上游引物：SEQ ID NO. 4：GACCACCATCACCATCTTCA

下游引物：SEQ ID NO. 3：GGGTGGACGACAGATGC

PCR反应体系

模板 1ul

上游引物 1ul

下游引物 1ul

2X taqplus 12.5 ul

二馏水 9.5ul

反应的条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃ 延伸5min；PCR产物进行测序，若在sgRNA序列的第19位的G突变成A，则证明获得单碱基突变。

本发明单链设计是依据sgRNA序列，在IGHG基因序列上sgRNA序列的左右选择各加上50bp，并对sgRNA上的第19位的G突变成A，特异性的寡聚核苷酸单链序列为SEQ ID NO.2。

本发明针对兔IGHG序列，设计针对其尾部酪氨酸基序进行突变的sgRNA，特异性sgRNA序列为SEQ ID NO. 1。

本发明sgRNA合成方法：采用固相亚磷酰胺三酯法，以商业化DNA合成仪为主要合成平台进行生产，将单个核苷酸进行连接，形成短链DNA，合成时从3’-5’方向进行，相邻的核苷酸通过3’-5’磷酸二酯键连接，通常3’端第一个碱基结合在CPG上；步骤：经过脱保护，活化缩合，盖帽和氧化四个步骤完成一个碱基的添加；上游：5’-CTACAGGAACATGATCGGGC-3’

下游5’-GCCCGATCATGTTCCTGTAG-3’。

本发明为开发兔单克隆抗体提供一种手段，促进抗体制备技术将在诊断、药效学及临床应用中发挥前所未有的重大作用，引领新型治疗性抗体研究的崭新时代。