[发明专利]一种制备高产EPA裂殖壶菌的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种制备高产EPA裂殖壶菌的方法，利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术进行诱变育种、2‑脱氧葡萄糖(2‑DG)平板筛选技术、摇瓶发酵及GC定量分析技术选育EPA高产菌株最终获得两株高产突变株，其中一株裂殖壶菌EPA产量提高了23.32％，另外一株裂殖壶菌提高了41.27％，经济效果显著。

技术领域

本发明属于微生物遗传育种技术领域，涉及生产二十碳五烯酸的裂殖壶菌突变株的方法，即一种制备高产EPA裂殖壶菌的方法及其应用。

背景技术

二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)属于ω-3多不饱和脂肪酸，是人体自身不能合成但又不可缺少的重要脂肪酸。在日常饮食基础上增加EPA的摄入、吸收对预防和治疗动脉硬化、脑血栓和高血压等具有明显效果。EPA的开发和利用已成为保健品和医药领域的热点之一，目前EPA的商业来源主要是深海鱼油，但深海鱼油生产成本高，且产量不能满足市场需求。随着EPA的拓展应用和需求增加，开发新的EPA原料来源十分重要。

裂殖壶菌(Schizochytrium)是一种类真菌类的单细胞异养原生生物，具有生长速度快、细胞内EPA和脂肪酸含量高等优势，可作为EPA生产的替代来源。

2-脱氧葡萄糖(2-DG)是一种葡萄糖类似物，可抑制酵母和丝状真菌的生长，当将其掺入合适的培养基中时，不会导致突变菌株的分解代谢物抑制，仅允许突变菌株抵抗这种形式的抑制形成菌落。

使用传统的发酵优化策略已经很难再进一步提高EPA的产量，因此培育EPA高产微生物新菌株显得尤为重要。常压室温等离子体(ARTP)新型诱变仪具有突变快、突变多样性高、简单易行等诸多优势。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术、2-脱氧葡萄糖(2-DG)平板筛选技术、摇瓶发酵及GC定量分析技术选育EPA高产菌株，提供一种制备高产EPA裂殖壶菌的方法。

具体的，本发明提供的一种制备高产EPA裂殖壶菌的方法，包括以下步骤：

S1：选取对数时期的裂殖壶菌，用无菌蒸馏水制成菌悬液；

S2：将菌悬液置于ARTP诱变仪内进行辐照处理；

S3：取辐照后的菌悬液稀释后均匀涂布在固体平板上，于培养箱中避光保存；

S4：挑选单菌落摇瓶发酵，筛选辐照后致死率高的菌液作为出发菌株；

S5：通过平板筛选，摇瓶发酵培养，检测EPA产量；

S6：根据EPA产量筛选高产EPA的裂殖壶菌菌株。

本发明中所述菌悬液是在裂殖壶菌对数时期使用无菌蒸馏水配制而成，所述菌悬液的细胞浓度OD660值为0.6～0.8。

本发明中所述使用ARTP诱变仪对菌悬液进行辐照处理包括以下步骤：

S21：取菌悬液涂布在无菌载片上，将无菌载片转移至ARTP诱变仪凹槽内，凹槽下放置EP管；

S22：开启ARTP诱变仪，设定辐射时间为15～20s，功率为110w，气量为10SLM；

S23：诱变完毕将载片转移至装有1mL浓度为1mol/L山梨醇的EP管内，振荡洗脱形成新的菌悬液。

本发明中所述避光保存温度为26～30℃，培养时间为3d。

本发明中所述固体平板使用的培养基为2-DG固体培养基，所述2-DG固体培养基的组分以质量份计，每1000份固体培养基包括，硫酸钠12份，七水硫酸镁2份，硫酸铵4份，氯化钾0.5份，硫酸钾0.65份，氯化钙0.17份，味精10份，葡萄糖50份，磷酸二氢钾1份，酵母粉10份，2-DG 0.6份，琼脂粉20份，余量为无菌水。