[发明专利]一种可高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母构建方法

说明书

本发明公开了一种重组表达载体，包括pPIC9K‑amy载体和pGAPZA‑PDI载体，其中，pPIC9K‑amy载体由α‑淀粉酶目的基因amy和表达载体pPIC9K连接而成；pGAPZA‑PDI载体由伴侣因子目的基因PDI和表达载体pGAPZA连接而成以所述引物构建重组毕赤酵母菌株，将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建重组菌株，然后将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中，得到高效表达饲用低温α‑淀粉酶的毕赤酵母菌。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵技术领域，更具体地说是涉及一种可高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母构建方法。

背景技术

淀粉是单胃动物能量的主要来源，其供能占总能量需求的60％～80％。幼龄动物消化系统发育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。随着动物日粮配方的富营养化、饲养条件应激和环境污染问题越来越突出，成年健康动物添加“外源性营养消化酶”的作用也越来越明显，意义也越来越大。通过添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化吸收，对于提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。

目前饲料专用淀粉酶的研究开发较少，一般均采用食品加工、化纤，印染等工业用酶。中温α-淀粉酶是饲料工业中应用最多的淀粉酶，其最适作用温度为70～80℃，pH值5.0以下失活严重。动物生理环境温度一般为37～42℃，胃内pH值较低，中温淀粉酶在动物消化道内发挥作用甚微。低温淀粉酶最适作用温度比中温淀粉酶要低20～30℃，因此，研究开发低温淀粉酶对饲料用酶而言具有重要意义。

饲用淀粉酶应具备以下几个条件:在动物体温(37～42℃)的温度条件下能发挥高的活性；最适pH值与消化道内食糜的pH相一致；对淀粉有高的酶解效率(内切酶)；具有良好的稳定性(在饲料高温制粒过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐受性)。

α-淀粉酶最适温度为35℃左右，与饲用淀粉酶标准相似，如果能通过发酵工程策略，将表达α-淀粉酶的基因转化至菌种中，提高毕赤酵母外源蛋白表达量，则可以提高专用α-淀粉酶的产量。

因此，如何构建一种重组表达载体、高效表达α-淀粉酶的毕赤酵母菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组表达载体、应用、重组菌株和发酵方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组表达载体，包括pPIC9K-amy载体和pGAPZA-PDI载体，其中，pPIC9K-amy载体由α-淀粉酶目的基因amy和表达载体pPIC9K连接而成；pGAPZA-PDI载体由伴侣因子目的基因PDI和表达载体pGAPZA连接而成。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护上述重组表达载体在构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，过程为：将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建重组菌株，然后将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中，得到高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株。

作为上述技术方案优选的技术方案，将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中的过程为：以SEQ ID NO.6所示的基因序列为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2为引物，扩增低温α-淀粉酶的目的基因amy，构建表达载体pPIC9K-amy，将载体线性化后，整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建了重组菌株。