[发明专利]一种可高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母构建方法

权利要求书

1.一种重组表达载体，其特征在于，包括pPIC9K-amy载体和pGAPZA-PDI载体，其中，pPIC9K-amy载体由α-淀粉酶目的基因amy和表达载体pPIC9K连接而成；pGAPZA-PDI载体由伴侣因子目的基因PDI和表达载体pGAPZA连接而成。

2.权利要求1所述的重组表达载体在构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株中的应用。

3.一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，过程为：将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建重组菌株，然后将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中，得到高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母菌株。

4.根据权利要求3所述的一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，将目的基因amy整合到毕赤酵母感受态细胞中的过程为：以SEQ ID NO.6所示的基因序列为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2为引物，扩增低温α-淀粉酶的目的基因amy，构建表达载体pPIC9K-amy，将载体线性化后，整合到毕赤酵母感受态细胞中，构建了重组菌株。

5.根据权利要求4所述的一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，将扩增伴侣因子PDI的目的基因整合到重组菌株中的过程为：以SEQ ID NO.8所示的基因序列为模板，以SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所述序列为引物，扩增伴侣因子PDI的目的基因，构建表达载体pGAPZA-PDI，将载体线性化后，整合到重组菌株中。

6.一种毕赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株由权利要求3-5任一所述的构建方法构建得到。

7.权利要求3-5任一所述的构建方法构建得到的毕赤酵母在产饲用低温α-淀粉酶中的应用。

8.一种发酵产饲用低温α-淀粉酶的方法，其特征在于，过程包括：将权利要求3-5任一得到的毕赤酵母菌株活化，制成种子液，接种到BMGY培养基中，30℃、250rpm培养20h，离心收集菌体，接种到BMGY诱导培养基中，于30℃、250rpm诱导培养120h取样检测相关指标，并每隔24h添加2％(V/V)甲醇，将发酵液离心后，去除菌体沉淀，发酵液即为低温α-淀粉酶。

9.根据权利要求8所述的一种发酵产饲用低温α-淀粉酶的方法，其特征在于，1L BMGY生长培养基包括：1％酵母粉、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％(V/V)甘油，10％PBS pH 6.0缓冲溶液；

1L BMMY诱导培养基包括：1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，1％甲醇，10％PBS缓冲溶液。