[发明专利]一种基于CcmK2纤维状蛋白的亚精胺合成多酶复合体的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于CcmK2纤维状蛋白的亚精胺合成多酶复合体的构建方法及其应用。利用来源于自然界中的纤维小体中存在的相互作用蛋白对，将亚精胺合酶SpeE和S‑腺苷蛋氨酸脱羧酶SpeD分别融合粘连蛋白CohesinⅡ和锚定蛋白DockerinⅡ，利用CohesinⅡ和DockerinⅡ的相互作用，形成SpeE‑SpeD双酶结合体；再在CohesinⅡ上融合结合分子肽SpyTag，将SpeE‑SpeD双酶结合体组装到融合结合蛋白SpyCatche的纤维状蛋白CcmK2上；形成多酶复合体。本发明多酶复合体在多酶之间形成底物通道，拉近底物与酶之间的空间距离，提高了中间体的传递效率，充分发挥双酶间的协同作用，大大提高了亚精胺的合成效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于CcmK2纤维状蛋白的亚精胺按合成多酶复合体的构建方法及其应用。

背景技术

亚精胺是一种自然界中广泛存在的多胺类物质，几乎存在于自然界的所有动植物体内。亚精胺在DNA的复制、翻译和转录方面起着至关重要的作用，具有促进心血管保护、参与蛋白质与RNA的合成、抗氧化、抗炎、诱导细胞自噬、调节神经、改善线粒体代谢、延缓衰老、提高记忆力等多种功能。在农业和医学上，亚精胺也有着广泛的应用：在农业上，亚精胺应用于调节植物生长代谢，抵抗环境变化带来的副作用，提高果实产量与质量；在医学上，亚精胺可以作为治疗由不同蛋白病变引起的神经退行性疾病的潜在开发药物。

目前生产亚精胺的方法主要有化学法、提取法和发酵法。化学法以1,4-丁二胺和丙烯腈为原料，通过加成、氢化和还原反应得到亚精胺，由于反应条件苛刻，残留的底物难去除，导致提纯成本高，限制了亚精胺的工业化生产；提取法制备亚精胺通常是以谷类物质如薏米为原料，经碾碎、酸水解(或碱水解，酶水解)后再通过树脂交换等分离方法收集洗脱液即为亚精胺，由于制作繁琐，产物纯度低导致目标产品价格昂贵，不适用于大规模生产；生物发酵法主要以葡萄糖或蔗糖作为碳源，通过微生物(酿酒酵母或芽孢杆菌)代谢生成亚精胺，相较于前两种制备方法，发酵法产亚精胺具有条件温和，生产成本低的优势。但该方法也存在限制性因素，如产物量少，菌株产物耐受性差等，因此开发一种绿色高效的亚精胺生物合成路径具有重要意义。

体外酶催化的合成方法可通过一步或简单几步的酶催化反应达到合成的目的。利用S-腺苷蛋氨酸脱羧酶和亚精胺合酶可以催化S-腺苷蛋氨酸和丁二胺合成亚精胺。S-腺苷蛋氨酸脱羧酶催化S-腺苷蛋氨酸形成脱羧的S-腺苷蛋氨酸，丁二胺与脱羧的S-腺苷蛋氨酸反应，在亚精胺合酶的作用下转移其氨基丙基接到丁二胺后形成亚精胺。酶法级联催化合成亚精胺存在催化时间较长的问题，原因是两种酶都以游离酶的形态存在，由S-腺苷蛋氨酸脱羧酶形成的脱羧S-腺苷蛋氨酸均匀扩散在溶液中，局部浓度较低即中间产物的传递存在问题，导致最终的反应速率受到限制。

通过构建多酶组装体在多酶之间形成底物通道，可以提高多酶级联反应的催化效率。例如Zhenjun Liu等利用SpyTag/SpyCatcher自反应系统高效稳定的共价偶联特征构建了两种蛋白支架。将酶与蛋白支架用对接蛋白进行组装得到的多酶纳米结构有效的提高了甲萘醌生物合成的催化速率和产物产量。细菌微室的外壳蛋白，在大肠杆菌中过表达会形成密集的轴向蛋白丝。在体外，同样可以自组装形成该结构。可以作为天然的蛋白支架。Guoqiang Zhang等将乙醇胺利用细菌微室的外壳蛋白EutM与结合蛋白SpyCatcher融合表达构建蛋白支架，再将酶与结合分子肽SpyTag融合表达后与蛋白支架进行组装。最终形成的蛋白质支架多酶组装系统与游离酶系统相比，提高了手性胺的合成速率。利用粘连蛋白和锚定蛋白之间的相互作用将亚精胺合酶和S-腺苷蛋氨酸脱羧酶连接，虽然构建了底物通道，但是在整个反应体系中，SpeE-SpeD双酶结合体仍处于游离状态，组装技术带来的邻近优势并未完全发挥。

发明内容