[发明专利]一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用

说明书

本发明公开了一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用，涉及生物技术领域。本发明公开了一种重组猫传染性腹膜炎病毒，其特征在于，构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC‑FIPV‑791146的ORF3区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒。通过体外生长曲线，遗传稳定性检测，证明了本发明的重组病毒能稳定表达纳米荧光素酶；利用重组病毒检测猫FIPV阳性血清，并利用重组病毒对天然化合物药库进行筛选，结果表明，本发明构建的重组病毒可以实现快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体，并且可以实现高通量筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用。

背景技术

猫冠状病毒(FCoV)广泛存在于猫体内，根据基因型的不同，分为猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。其中FECV只引起轻微的肠道症状，而FIPV可引起猫慢性、致死性的猫传染性腹膜炎。感染FIPV的猫只常出现体温升高、胸腹部积水、淋巴结增大、黄疸等症状，幼年猫比成年猫更易感，死亡率高达100％。

目前市面上没有针对猫传染性腹膜炎的疫苗，无法进行有效预防，同时用于治疗的药物极少，大多治疗手段为对症治疗配合使用广谱抗病毒药物或免疫调节剂，以减缓症状延长生命周期，但不能有效抑制FIPV降低死亡率。因此，需要建立快速检测中和抗体水平的方法，评估正在开发的各种疫苗，并确定猫只个体的免疫状态；同时急需建立一种快速筛选抗病毒药物的方法，以高效筛选用于潜在治疗猫传染性腹膜炎的药物。目前猫冠状病毒中和抗体检测及病毒滴度测定主要通过计算CRFK细胞病变孔数，实验者逐一观察，所需时间长。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明构建的重组病毒可以实现快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体，并且可以实现高通量筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种重组猫传染性腹膜炎病毒，构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC-FIPV-791146的ORF3区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒。

本发明还提供上述的重组猫传染性腹膜炎病毒在快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体中的应用。

本发明还提供了一种利用上述的重组猫传染性腹膜炎病毒快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体的方法，包括：将猫血液离心取上清，之后灭活；灭活后的血清稀释后，加入含100TCID₅₀的权利要求1所述的重组猫传染性腹膜炎病毒共孵育1h，之后再加入CRFK细胞悬液，继续共培养24h，之后取孔中上清检测荧光值，降低50％荧光素酶信号的血清浓度NT₅₀≥25即为阳性。。

本发明还提供上述的重组猫传染性腹膜炎病毒在快速筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物中的应用。

本发明还提供一种上述的重组猫传染性腹膜炎病毒快速筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物的方法，包括：CRFK细胞进行消化传代后，用细胞生长液稀释，之后接种于96孔板，培养12h；之后弃去所述96孔板的孔中的培养基，清洗之后在接种CRFK细胞的每孔中，按照体积比9:1，分别加入MOI＝0.01的权利要求1所述的重组猫传染性腹膜炎病毒的稀释液和500μΜ的药物稀释液，继续培养48h后，取孔中上清检测荧光值；荧光值1×10⁶即为阳性，表示该浓度下的药物对病毒没有抑制作用。

本发明公开了以下技术效果：