[发明专利]降解长链烷烃的酵母菌株及其应用

说明书

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及降解长链烷烃的酵母菌株及其应用。本发明以解脂耶式酵母为底盘，将外源烷烃羟化酶基因模块整合酵母基因组，得到烷烃羟化酶外源单拷贝表达酵母菌株。在此基础上，对菌株进行优化，得到的烷烃羟化酶外源多拷贝表达酵母菌株，其降解效率可达71.50％，烷烃降解酶活性为0.65U/mg，并在以葡萄糖为底物时其降解效率较高；更进一步强化，得到的内源性烷烃转运蛋白与外源烷烃羟化酶基因模块组合的菌株烷烃降解效率进一步提高，降解效率可达75.12％，疏水性为91.8％。并且，外源基因模块整合菌株烷烃降解效率优于内源基因模块整合菌株。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及降解长链烷烃的酵母菌株及其应用。

背景技术

随着我国经济和社会迅速有力地发展，对能源的需求和消耗量也在不断增加。然而，各种溢油事故的发生率也在不断增加，给我国的环境和经济造成了不可估量的破坏。随着环保意识的增强，石油烃环境污染的生物修复研究不断加强。与常用的物理和化学修复方法相比，生物修复由于其效率高、副产物环保、成本低等优点而受到越来越多的关注。近年来，通过系统生物学策略改造的基因工程菌已经实现了对多种石油污染物的生物降解。在代谢工程策略和合成生物技术的帮助下，基因工程已被证明可以切实有效地提高微生物的整体能力。功能基因不仅是研究石油降解微生物的群落结构特征、固有降解菌和降解潜力的基础，也是构建基因工程菌进行生物修复的依据。如将来源于Acidovorax sp.CHX100的环己烷降解功能基因：细胞色素P450、铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白，在菌株Pseudomonas taiwanensis VLB120中进行过量表达，可极大地提高菌株对环己烷的氧化降解效能。微生物整体能力的提高直接表现为对石油污染物降解效率的提高；Diana V.Cortés-Espinosa等人筛选并获得了一株可以降解菲的黑曲霉菌。通过将来自寒带菌的锰过氧化物酶基因(mnp1)整合到其中，黑曲霉对土壤中的菲的去除率提高到31.94％。这些成功案例表明，系统生物学在强化石油污染物降解菌和加速生物修复方面具有巨大潜力。

现有的石油烃降解菌研究集中在细菌领域，虽然细菌可以利用多种石油成分，但它们对简单结构和短链烷烃的消化能力强于长链烷烃和多环芳烃。并且大部分石油烃降解菌基因组信息和代谢网络不清晰，基因操作难进行，所以目前，酵母由于其遗传背景清晰，分子操作方便的特性，而被用于构建烷烃降解工程菌。但以酿酒酵母为底盘的烷烃降解工程菌对长链烷烃降解效率低，很难达到工业化对烷烃的降解需求。所以需要对以酵母为底盘的工程菌株进行优化及改造，进一步提高石油烃的降解效率。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供降解长链烷烃的酵母菌株及其应用。

本发明提供了一种核酸组合，包括：编码烷烃羟化酶的核酸和编码烷烃转运蛋白的核酸。

本发明中，所述编码烷烃羟化酶的核酸包括如下I)～IV中的任意一种：

I)、AlmA1、LadA或AlmA2，其中，AlmA1的来源为Acinetobacter sp.ADP1；LadA的来源为Geobacillus thermodenitrificans NG80；AlmA2的来源为Acinetobacter sp.M-1；

II)、与如I)所示的核酸具有至少80％同源性且与I)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；

III)、如I)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；

IV)、与如I)所示的核酸互补或部分互补的核酸。

本发明中，所述编码烷烃转运蛋白的核酸包括如下i)～iv)中的任意一种：

i)、来源于解脂耶式酵母的烷烃转运蛋白ABC1；

ii)、与如i)所示的核酸具有至少80％同源性且与i)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；