[发明专利]一种双启动子质粒及其构建方法和应用

说明书

本申请公开了一种双启动子质粒及其构建方法和应用。该质粒包括：真核CMV启动子、核糖体结合位点、T7 RNA聚合酶基因、T7启动子、多聚腺嘌呤核苷酸序列、牛生长激素多腺苷酸化信号序列以及目的基因。该质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由CMV启动子启动T7 RNA聚合酶基因转录，翻译产生T7 RNA聚合酶，所述T7 RNA聚合酶识别质粒上的T7启动子，转录目的基因翻译成蛋白质。质粒载体通过与目标基因精确结合，并载入表达系统，获得更高表达量的目标蛋白。

技术领域

本申请涉及质粒构建技术领域，尤其涉及一种双启动子质粒、构建方法及其应用，更具体的是，通过所构建的双启动子质粒瘤内表达细胞因子抑制肿瘤生长。

背景技术

载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体，载体构建即是构建含外源DNA的质粒。

现有技术中，利用基因工程制备重组免疫蛋白时，通过应用质粒中CMV promoter（巨细胞病毒启动子）等强启动子的在真核表达系统（如肿瘤细胞）里表达获得相关免疫蛋白，这种方法具有表达量较低、获得的重组蛋白含量少、成本较高等问题。

因此，亟需构建一种质粒载体，该质粒载体通过与目标基因精确结合，并载入表达系统，获得更高表达量的目标蛋。

发明内容

针对以上技术问题，本申请构思在于，提供一种连续双启动子质粒，优化基因的表达结构，即构建区别于现有技术的重组质粒结构，使其在表达系统中能够更高量地表达目标蛋白。

结合以上构思，本申请提供了一种具备双启动子的全新结构的质粒载体，所述质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由巨细胞病毒（下简称“CMV”）启动子启动T7 RNA聚合酶基因转录，翻译产生的T7 RNA聚合酶，所述T7 RNA聚合酶识别质粒上的T7启动子，转录目的基因（GOI)翻译成蛋白质，由于，利用T7 RNA聚合酶对T7启动子转录具有一个放大的作用，因此，所述质粒在进入肿瘤细胞后可以产生更多量的目标蛋白。

第一方面，本申请实施例公开了一种质粒，所述质粒包括：

CMV启动子；所述的CMV启动子序列如SEQ ID NO：1所示；

核糖体结合位点(IRES)；所述IRES的序列如SEQ ID NO：2所示；

T7 RNA聚合酶基因；所述T7 RNA聚合酶基因的序列如SEQ ID NO：3所示；

T7启动子；所述T7启动子的序列如SEQ ID NO：4所示；

多聚腺嘌呤核苷酸(pA)序列；所述pA序列为多个腺嘌呤A连在一起组成的RNA序列；

牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)序列；所述BGHpA序列如SEQ ID NO：5所示；以及

目的基因（GOI)。

进一步地，在构建的质粒中，T7 RNA聚合酶基因序列位于真核CMV启动子下游，BGHpA序列位于T7 RNA聚合酶基因下游，T7启动子位于BGHpA序列下游，IRES的序列位于T7启动子下游，目的基因（GOI)位于IRES下游。

进一步地，在构建上述质粒过程中，原核表达的T7启动子来源于T7噬菌体，是一种大肠杆菌表达系统常用的强启动子，它能够对T7 RNA聚合酶有特异性反应，被识别后的转录非常活跃；

CMV启动子作为增强子/启动子元件，这类元件来源于病毒基因组，CMV启动子是公认的启动真核基因表达最有力量的启动子，在很多真核细胞中都有很强的促进转录的作用，启动效率比较高；