[发明专利]一种制备高催化活性mNampt突变体的方法及其突变体、重组菌以及应用

说明书

本发明提供了一种制备高催化活性mNampt突变体的方法及其突变体、重组菌以及应用，属于基因突变技术领域。本发明提供的制备高催化活性mNampt突变体的方法，包括如下步骤：以mNampt作为模板，采用引物序列进行定点突变PCR扩增，筛选mNampt催化活性提高的突变体，所述引物序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。采用本发明方法制备所得的10株突变体除第二株突变体外其余9株突变体催化活性均有所提高。其中，第六株突变体(SEQ ID NO.7)在相同条件下催化底物NAM所得产物NMN的含量高达357.084μmol/L，同野生型mNampt相比提高79.05％。

技术领域

本发明属于基因突变技术领域，尤其涉及一种制备高催化活性mNampt突变体的方法及其突变体、重组菌以及应用。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(NMN)作为辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的关键前体，对人类身体健康具有重要意义，如NMN具有改善缺血性心脑组织损伤、修复氧化相关的身体机能障碍、治疗代谢性疾病等重要作用。人体临床试验表明，NMN具有良好的安全性，且可有效促进身体机能。基于其人体安全性和生物活性，NMN被广泛地应用于食品原料、药品、保健品及护肤品等行业。因此有必要探寻经济且高效的NMN生产方法降低NMN原料成本。

目前技术较为成熟的化学法合成NMN易出现手性问题，且有机溶剂的残留也限制了其在市场中的应用。而酶法制备NMN具备有反应简便、产品活性高及污染程度低等优点，代表了制备NMN的发展趋势。根据底物不同，酶法合成NMN的路径主要分为烟酰胺(NAM)路径和烟酰胺核糖(NR)路径两种。其中烟酰胺路径的限速酶为烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)，Nampt催化底物烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成NMN。该路径在工业化酶法制备NMN有一定的应用，但有其瓶颈所在：Nampt转化效率低，导致烟酰胺路径制备的NMN产率低下，故亟需获得一种酶活显著提高的Nampt，解决烟酰胺路径制备NMN在工业化生产上的瓶颈。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备高催化活性mNampt突变体的方法，能够获得酶活提高的突变体。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种制备高催化活性mNampt突变体的方法，包括如下步骤：以mNampt作为模板，采用引物序列进行定点饱和突变PCR扩增，筛选mNampt催化活性提高的突变体，所述引物序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述PCR扩增程序为98℃3min，98℃10s，58℃10s，72℃80s，30个循环，72℃10min。

优选的，所述PCR扩增体系为Prime STAR Max Premix 12.5μL，正反引物序列各0.5μL，模板0.5ng，ddH₂O补足至25μL。

本发明还提供了一种利用上述方法获得的小鼠来源的mNampt突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-11所示。

本发明还提供了一种表达上述突变体的重组菌。

优选的，所述菌包括E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供了一种上述重组菌的制备方法，包括如下步骤：将上述方法所得的扩增产物进行DpnI酶切，获得突变后的重组质粒，将突变后的重组质粒转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)内，培养基培养，长出的单菌落即为突变体菌株。

本发明还提供了一种上述突变体或上述重组菌在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。