[发明专利]特异性识别黄曲霉毒素M1的适配体及其筛选方法与应用

说明书

本发明涉及特异性识别黄曲霉毒素M1的适配体及其筛选方法与应用。本发明具体的方法为：在三段式文库中间的随机区域插入结构化序列，形成具有稳定茎‑环结构的五段式文库。以经过设计的五段式序列为初始文库，应用GO‑SELEX技术对黄曲霉毒素M1进行筛选，经过六轮的反复筛选、亲和力和特异性试验的分析验证，获得了两条能识别黄曲霉毒素M1的核酸适配体且其均具有良好的亲和性和特异性。该两条核酸适配体在准确、快速、灵敏检测食品中黄曲霉毒素M1方面具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，尤其涉及特异性识别黄曲霉毒素M1的适配体及其筛选方法与应用。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一类由黄曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)和特异曲霉(A.nomius)等曲霉属真菌产生的次级代谢产物，广泛分布于自然界中。目前发现的黄曲霉毒素约20多种，其中研究较多的有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1及黄曲霉毒素M2六种。黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)是黄曲霉毒素B族(AFB1和AFB2)的羟基化衍生物，它们主要存在于乳及乳制品、鸡蛋、霉变谷物、含有油脂的干果及动物的肌肉、尿液、乳汁、血液等中。当动物摄入饲料中的AFB1后，将在动物体内肝微粒体酶作用下经体内循环代谢产生AFM1并存在于其肌肉、乳汁、尿液中。黄曲霉毒素M1来源广、监控难并且毒性强，其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，是目前公认的最毒的化学致癌物质之一。世界卫生组织国际癌症研究机构(International agency forresearch on cancerofthe world healthorganization)将AFB1和AFM1划分为I类致癌物。因此，实现食品中黄曲霉毒素M1准确、快速、灵敏地检测，对于预防黄曲霉毒素M1的传染、保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。

目前，AFM1检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相质谱联用法(HPLC-MS/MS)及基于抗原-抗体免疫识别建立的免疫法等。薄层层析法操作步骤较繁琐，灵敏度及特异性低，已不能满足现代检测的需要。而常用的色谱分析法，样品前处理方法复杂、繁琐，且需要熟练掌握仪器操作技术，不便基层推广。免疫法检测霉菌毒素虽具有灵敏度高、特异性强等优点，但是小分子抗原的制备过程繁琐耗时、成本昂贵，不同批次间抗体存在差异性，储存及使用条件严苛，导致假阳性率高、重复性差。

核酸适配体(Aptamer)是从体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。核酸适配体类似于抗体，但是相比于抗体，核酸适配体具有体外合成周期短、耐高温、可重复利用和长期保存、价格低廉、易于合成和修饰等优点。这些独特优势使适配体在疾病治疗、药物开发、环境检测和食品安全检测等领域具有广阔的应用前景。氧化石墨烯-SELEX(GO-SELEX)是一种方便、高效的筛选方法，借助氧化石墨烯快速吸附单链DNA(ssDNA)从而将实现结合靶标的寡核苷酸链与未结合的寡核苷酸链的分离。分离效率是影响适配体筛选效率的关键步骤。近年来，研究在关注分离步骤的效率的同时，也更多关注于文库复杂性对于适配体筛选效率的影响。核酸适配体的结构越复杂，它与靶标结合的亲和力就越高。研究认为对初始文库进行设计可以增加复杂结构适配体出现的概率。常用的适配体筛选文库多为三段式，即中间为随机区域，两端为固定碱基区域。五段式文库被证明比三段式文库更容易折叠成复杂结构。因此，基于文库设计和分离技术相结合的适配体筛选已经成为当前的研究热点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了特异性识别黄曲霉毒素M1的适配体及其筛选方法与应用。本发明的目的是提供一种针对毒素小分子靶标的分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配体技术快速、准确检测黄曲霉毒素M1的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：