[发明专利]一种生成带有任意定点修饰的蛋白的方法及定标品

说明书

本发明公开了一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，特定位点修饰为M，M周围的连接若干氨基酸为XXX，形成XXX‑M‑XXX；方法包括以下步骤：(1)在蛋白质P的羧基端或氨基端添加酶学识别模块A或a，制得P‑A或a‑P；(2)通过多肽合成，使酶学识别模块a或A与XXX‑M‑XXX反应生成a‑XXX‑M‑XXX或者XXX‑M‑XXX‑A；(3)通过酶学反应，使用蛋白连接酶催化，在氨基端或羧基端进行连接，使P‑A或a‑P与a‑XXX‑M‑XXX或XXX‑M‑XXX‑A反应，得到P‑A‑a‑XXX‑M‑XXX，或XXX‑M‑XXX‑A‑a‑P；A和a为带有特定互补酶识别序列的两个多肽片段。由于A和a直接共价连接，本方法可适用于任何蛋白，任何特定位点，任何修饰单位。经过验证，此类定标品可以和相关检测试剂进行很好的反应，并且没有明显的交叉反应，有极好的特异性。

技术领域

本发明涉及一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法及定标品，属于生物技术领域。

背景技术

蛋白质的翻译后修饰是蛋白质状态的重要指标，对于蛋白质的功能也经常起到重要的作用。若干已知的特定蛋白质位点的修饰是重要的诊断标志物，如阿尔茨海默症中Tau蛋白181，217以及231位点的磷酸化以及血栓中Wasp蛋白239 位点磷酸化。陆续地，还有许多新的蛋白修饰标志物被发现。

生成带有特定位点修饰的蛋白，尤其是其他位点均不修饰的单位点修饰蛋白对翻译后修饰，对于标志物的开发与定量有核心的意义，但现有的技术手段尚不可能做到。

发明内容

为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法及定标品。以解决背景技术中提到的问题。

为了达到以上目的，本发明采用的技术方案是：一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，特定位点修饰为M，M周围的连接若干氨基酸为XXX，形成XXX-M-XXX；所述方法包括以下步骤：

(1)在蛋白质P的羧基端或氨基端添加酶学识别模块A或a，制得P-A或a-P；

(2)通过多肽合成，使酶学识别模块a或A与XXX-M-XXX反应生成a-XXX-M-X XX或者XXX-M-XXX-A；

(3)通过酶学反应，使用蛋白连接酶催化，在氨基端或羧基端进行连接，使P-A或a-P与a-XXX-M-XXX或XXX-M-XXX-A反应，得到P-A-a-XXX-M-XXX，或XXX- M-XXX-A-a-P；

所述A和所述a为带有特定互补酶识别序列的两个多肽片段。

本发明进一步的设置为：所述A为连接在蛋白质P的羧基端的具有LPEXG模块的蛋白或多肽，所述a为连接在蛋白质P的氨基端上具有GGG的蛋白或多肽。

本发明进一步的设置为：所述步骤(1)的产物P-A或a-P是通过DNA改造，在蛋白质P的羧基端或氨基端添加酶学识别模块A或a制得的。

本发明进一步的设置为：所述步骤(1)的产物P-A或a-P是在蛋白连接酶的催化下合成的。

本发明还提供了一种定标品，所述定标品是上述任一项所述的P-A-a-XXX-M -XXX，或XXX-M-XXX-A-a-P。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于两个带有特定互补酶识别序列的多肽片段直接共价连接，本方法可适用于任何蛋白，任何特定位点，任何修饰单位。经过验证，此类定标品可以和相关检测试剂进行很好的反应，并且没有明显的交叉反应，有极好的特异性。生成的定标品和体内蛋白非常可比的反应性，而无显著的彼此之间的交叉反应，是非常理想的试剂开发中间产物。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

具体实施方式