[发明专利]催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶

权利要求书

1.催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶。

2.编码权利要求1所述重组糖基转移酶的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示。

3.一种表达催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的重组菌株，其特征是用下述方法构建：将权利要求2所述重组基因构建至表达载体，获得重组载体；将所述重组载体转化宿主菌株中获得重组菌株。

4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于所述表达载体为pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pET-28a、pMAL或pBAD30。

5.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于所述宿主菌株为大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母菌。

6.权利要求3的重组菌株的诱导表达，其特征是包括如下步骤：将权利要求3所述重组菌株进行培养并加入诱导剂，在15–37℃，诱导表达6–27h，获得含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞；将所述菌体细胞破胞，得到催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液。

7.含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞催化Reb A生产Reb M的方法，其特征是包括如下步骤：

取终OD₆₀₀为25–250权利要求6所述的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞或经过通透性处理的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞，加入终浓度为1–10g/L Reb A、终浓度为4–10mM尿苷二磷酸葡萄糖和终浓度为0.4–1mM的Mn²⁺，加入终浓度为50mM的pH为7.2–8.0的PBS，在26℃–42℃、转速为50–250rpm、反应10–24h，催化生成Reb M；

所述经过通透性处理的含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞用下述方式制备：

方式一：将含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞在-20°～-80℃冷冻0.5–24h；

方式二：将含有催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的菌体细胞用终浓度为0.15–0.45g/L的细胞通透剂重悬，在20–30℃静置5min–1h；所述细胞通透剂为十六烷基三甲基溴化铵、曲拉通X-100、聚山梨酯-80或十二烷基硫酸钠。

8.催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液催化Reb A生产Reb M的方法，其特征是包括如下步骤：

取终浓度为1–5g/L权利要求6所述的催化Reb A生产Reb M的重组糖基转移酶的酶液，加入终浓度为1–10g/L Reb A，终浓度为1–8mM尿苷二磷酸葡萄糖和终浓度为0.1–6mM金属离子，加入终浓度为50mM的pH为5.5–10.5的缓冲液，在26℃–42℃反应12–96h，催化生成RebM；

所述金属离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺或Pb²⁺。