[发明专利]萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌菌株及构建方法

说明书

本发明公开一种萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌菌株及构建方法，该菌株命名TM‑LUC菌株，其微生物保藏号是：CGMCC No.10452；本发明中该萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌菌株及构建方法包括：S1、构建萤火虫荧光素酶重组质粒；S2、转入TM的基因组。本发明将萤火虫荧光素酶转入TM基因组中，令TM可以编码荧光素酶，在底物荧光素作用下进行生物发光，替代传统的ATCC18224菌株，TM‑LUC感染动物后，腹腔注射荧光素底物理论上可令菌株发光，实现动物体内菌株分布的监测；也可以监测给药后的治疗过程；对于潜伏感染机制的探索提供了新方向。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌菌株的构建方法。

背景技术

马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)是一种机会性致病菌，同时也是篮状菌属中唯一已知的致病性真菌，其高发于免疫缺陷病病人群体。TM感染是一种区域性感染疾病，主要流行于中国南部与东盟各国AIDS人群中。在广西，艾滋病合并TM感染的死亡风险较于其他机会性感染更高(AHR＝4.51)。因其高患病率与病死率，TM感染已成为东南亚与中国南部沿线国家的严重公共卫生问题。

临床上针对TM感染的患者多采用两性霉素B进行治疗，相较于传统的伊曲康挫会更加有效，即便如此，疗效也未能达到非常理想的结果。不少的临床病例报告表明TM在初期治愈后，若在一段时间内不坚持服药，则会存在复发的风险。这表明，TM在机体内可能存在着一套成熟的免疫逃逸策略，而且还会在机体内潜伏，并能在特定条件下重新复燃。然而，有关TM潜伏再感染的机制知之甚少，包括TM潜伏的部位、复燃的机制等尚未被阐明。其主要原因在于缺乏合适的TM感染可视化模型，传统的TM-小鼠感染模型存在以下缺点：(1)需要在不同时间点宰杀小鼠，取不同脏器进行真菌培养以获得菌载数据，因此需要大批量小鼠；(2)由于TM培养阳性率仅有70-80％，故潜伏后的TM由于菌载量低，大多不能培养出来，因此无法判断其潜伏部位；(3)由于个体差异，不同批次或同一批次不同老鼠的感染进程有所不同，因此会造成实验误差。造成以上缺点的原因主要是缺乏萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌。目前国内外也缺少相关研究。

另外，生物发光成像技术(Bioluminescence imaging,BLI)因其非侵入性、可定量分析、灵敏度高等优点被广泛应用于生物医疗领域。其中研究最为深入的是萤火虫荧光素酶。萤火虫荧光素酶报告系统常为萤火虫荧光素酶/D-荧光素底物。D-荧光素底物在萤火虫荧光素酶的催化下转变为激活状态的氧化荧光素，在这过程中会发出生物荧光。荧光素成像可视化模型可通过对同一组实验对象在不同点进行记录，追踪同一观察目标的扩散进程，因此所得的数据更加真实可信。此外，该发光系统检测灵敏度高，其穿透性可达3-4cm，可以检测到小鼠体内位置较深的脏器(小鼠身体厚度约7-8cm)，且只要细胞总数达到100个以上，便能检测到信号。因此，该技术在动物模型体内的肿瘤负荷或者治疗效果监测方面得到广泛的应用。在真菌研究方面，编码萤火虫荧光素酶的白色念珠菌在小鼠内的成像显示了其隐形感染部位，这为白色念珠菌的治疗带来了新的方向并且一定程度解释了白色念珠菌复发的原因。这表明萤火虫荧光素酶广泛的适用性。

TM做为HIV机会性感染的常见真菌，其高复发率和死亡率严重影响了AIDS人群的预后。因此，针对TM的治疗药物开发应当需要更多更深入的研究。本申请提出构建萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌，为后续TM感染可视化模型的构建奠定扎实基础。萤火虫荧光素酶标记的TM，将在传统的基础研究上加入生物发光技术，这会为TM动物模型研究带来新的方向，并且使得TM在动物体内的感染部位与治疗效果的监测成为可能。

发明内容

为此，本申请提供如下技术方案：

一种萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌菌株Talaromycesmarneeffei，命名为TM-LUC菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究院，其微生物保藏号是：CGMCC No.40152，保藏时间为2022年3月 25日。