[发明专利]一种大肠杆菌重组表达载体及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌重组表达载体及其应用。本发明的表达载体，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其在构建时，是将InaXn冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白和plCSA‑BP目标蛋白的编码基因构建成重组质粒后，转入减毒大肠杆菌得到。本发明通过将plCSA‑BP与InaXn冰核蛋白融合表达，中间连接sfGFP作为荧光指示蛋白，使得菌外膜囊泡表达相同的融合蛋白，并使囊泡分泌量提高，并且优于脂质体，具有更好的稳定性、生物相容性、安全性以及胎盘靶向性，可以装载siRNA靶向胎盘递送，是一种能有效保护siRNA的载体，能够有效促进胎盘病变相关的疾病治疗药物的开发。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌重组表达载体及其应用。

背景技术

胎盘样硫酸软骨素A(plCSA)为附着至蛋白聚糖的、交替的氨基糖和己糖醛酸残基的直链聚合物，已有研究证实plCSA广泛地在胎盘滋养细胞上表达。此外，研究证实，表达疟疾蛋白VAR2CSA的恶性疟原虫只粘附在胎盘上，VAR2CSA通过介导受恶性疟原虫感染的红细胞与合体滋养细胞表面的plCSA结合从而聚集在胎盘。可见，疟疾蛋白VAR2CSA可以特异性地与PLCSA结合。于是有研究者通过噬菌体筛选方法鉴定了来自VAR2CSA的最小plCSA结合区的肽，然后通过组织学分析证明了其靶向性，并将其命名为胎盘硫酸软骨素A结合肽(plCSA-BP)。因此，采用plCSA-BP制备的纳米粒子未来有望用作针对人类胎盘滋养细胞的靶向药物的工具。

小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)是一种靶向核酸的治疗药物。与小分子和单克隆抗体药物相比，siRNA有一个天然优势。小分子和单克隆抗体药物通常是依靠识别对应蛋白质复杂的空间构象来发挥作用。由于多数蛋白质的空间构象难以匹配吻合度高的小分子和单克隆抗体药物，以至于很多疾病都无法通过该类药物治疗。而siRNA是凭借与mRNA完全碱基互补配对的方式发挥作用。于是从理论上讲，siRNA可通过序列特异性的特点靶向沉默任何致病基因，以此对多种疾病都可以进行精准靶向治疗。但是siRNA药物所具有的一些致命缺点又极大地限制了其临床应用。例如裸露的siRNA极易被降解难以通过血液循环到达靶细胞、游离的siRNA很难进行跨膜运输、siRNA的有义链(或过客链)导致的脱靶效应等。为了清除上述障碍，让siRNA药物真正发挥出价值，相关学者致力于对siRNA进行各种化学修饰并开发出大量的递送系统，目前构建了包括脂质体、聚合物、细胞外膜囊泡、无机纳米颗粒、肽类大分子等递送载体。

在上述递送载体中，细菌外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)凭借粒径小、稳定、生物相容性好等优点成为一种理想的药物递送载体。细菌外膜囊泡是革兰氏阴性菌分泌的一种直径为30-200nm的球形纳米囊泡，属于磷脂双分子层蛋白脂质体，它在细菌的生命活动中发挥着重要作用，能够保护细菌免受有害物质侵害、调节细菌生物膜的形成、介导细菌间的交流等。

目前，工程化OMVs在靶向递送系统领域已经有不少研究，但是针对载siRNA胎盘靶向的工程化OMVs，现有技术中并未见相关报道。因此，如何制备并成功构建得到产率高、特异性强、安全性好，能够有效载siRNA的胎盘靶向的工程化OMVs，从而有效促进胎盘病变相关疾病治疗药物的开发，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

基于以上目的，本发明的目的之一在于提供一种大肠杆菌重组表达载体，其能够分泌在表面表达目标蛋白plCSA-BP的细菌外膜囊泡(OMVs)，并且产率高，胎盘靶向性好，能够有效作为siRNA载体。

本发明的目的之二在于提供一种大肠杆菌重组表达载体在生产细菌外膜囊泡中的应用，生产所得细菌外膜囊泡是一种具有安全性和靶向性、能够有效保护siRNA的OMVs载体。

为了实现上述目的，本发明的大肠杆菌重组表达载体，采用如下技术方案实现：