[发明专利]一种检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂盒及其使用方法

说明书

本发明属于微生物检测技术领域，公开了一种检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂盒及其使用方法。所述试剂盒内设有dH2O、上游引物冻干粉、下游引物冻干粉、Taq酶、PCRBuffer，其中，所述上下游引物序列分别为：For：5’‑CCAGCAAGCCGCGGTAATACATAGG‑3’Rev：5’‑GTGGACTACYAGGGTATCTAATCC‑3’上述试剂盒具体使用方法包括预变性、变性、退火、延伸并循环35次。本发明利用支原体PCR检测，在体外模拟体内的DNA复制，通过温度的变化来控制DNA的复性和变性，引物作为启动子，在Taq酶，dNTP的作用下可以扩增支原体特定的核酸序列，因此可以用于识别多种支原体。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂盒及其使用方法。

背景技术

大多数的支原体以球形为主，有三层结构的细胞膜具有极大的可变性，对人类和动物均具有一定的致病性并且能在无生命的人工培养基上生长繁殖。支原体的基因组多数为双链DNA，散布于整个细胞中的拟核或者没有形成的核区中。支原体的细胞膜中含甾醇，对保持细胞膜的完整性起了很大作用，革兰氏染色不易着色，支原体的种种特性都足以说明它不易被检测和清除的特点。

当细胞被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白质的表达均会发生不同程度的变化，但细胞生长速率一般并未发生显著影响，因此通过常规的观察方法一般很难以被察觉，而一旦被支原体污染，对细胞的影响很大，对于后续的实验操作或工艺生产有巨大危害，因此及时确定细胞是否被支原体污染是十分必要的。

目前电子显微镜或称相差显微镜观察法，即用扫描电镜或透射电镜直接去观察支原体形态，经观察可发现呈暗色颗粒状即为支原体。此方法虽然直接简单，但缺点为检测成本高，设备昂贵。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种检测细胞培养物支原体污染的 PCR试剂盒及其使用方法，通过建立PCR检测的方法建立了一种能鉴定支原体污染的PCR方法，准确性高、检测速度快、价格低廉、具有实际应用价值。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂盒，盒内设有dH2O、上游引物冻干粉、下游引物冻干粉、 Taq酶、PCRBuffer。

其中，所述上下游引物序列分别为：

For：5’-CCAGCAAGCCGCGGTAATACATAGG-3’

Rev：5’-GTGGACTACYAGGGTATCTAATCC-3’

进一步的，所述PCRBuffer数量为2管/盒。

上述试剂盒进行PCR扩增可产生分子量为280bp的特异性扩增产物，所述试剂盒具体使用方法为：

1.预变性：在温度95℃条件进行预变性，时间3min；

2.变性：保持温度不变，时间为30s；

3.退火：温度降至55℃，时间30s；

4.延伸：在72℃条件下维持35s；

步骤1-4循环35次，最后在72℃条件下维持10min，将温度降至4℃保存。

本发明与现有技术相比的有益效果是：(1)利用支原体PCR检测，在体外模拟体内的DNA复制，通过温度的变化来控制DNA的复性和变性，引物作为启动子，在Taq酶，dNTP的作用下可以扩增支原体特定的核酸序列，因此可以用于识别多种支原体；(2)利用通用引物可以一次性检测到14种支原体，包括口腔支原体、精氨酸支原体、蔡氏无胆甾原体、发酵支原体、猪鼻支原体、猪肺炎支原体、牛支原体、鸡毒支原体、衣阿华支原体、滑液支原体、絮状支原体、小鸡支原体、火鸡支原体、鸭支原体；(3)检测准确可靠，灵敏度高、速度快、特异型强、价格低廉，使用简单。