[发明专利]一种高产乳酰-N-四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

权利要求书

1.一种高产乳酰-N-四糖的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组与底物乳糖及关键中间产物分解代谢相关的基因，在大肠杆菌基因组的recA基因处整合编码二磷酸尿核苷-葡萄糖-4-差向异构酶的基因，异源性表达编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因和编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因wecB、编码葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶的基因nagB和编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ，编码二磷酸尿核苷-葡萄糖脱氢酶基因；所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB的NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB的NCBI序列号为NP_415204.1，β-半乳糖苷酶LacZ的NCBI序列号为NP_414878.1。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用pETDuet-1质粒表达编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因，利用pACYCDuet-1质粒表达编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因；所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在所述重组大肠杆菌中还加强表达编码鸟苷激酶的基因和鸟苷-5'-磷酸脱羧酶的基因；所述编码鸟苷激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码鸟苷-5'-磷酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还敲除glgC、rffH、yihX、nrdD或umpH。

6.一种生产乳酰-N-四糖的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌为微生物发酵菌株，以甘油为碳源，以乳糖为底物合成乳酰-N-四糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在含有DM培养基的摇瓶体系中培养至菌体OD₆₀₀达到0.6～0.8，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM并同时添加乳糖至终浓度为5g/L，后在25℃、200rpm下培养不少于96h；

或者，将所述重组大肠杆菌在含有DM培养基的发酵罐体系中培养至菌体OD₆₀₀达到12～15，添加IPTG至终浓度为0.2mM并同时添加乳糖至终浓度为10g/L，当罐内甘油浓度低于8g/L，补加甘油以维持发酵体系中甘油的浓度在8～15g/L，并通过添加氨水维持发酵罐中pH6.6～6.8，并保持溶氧20％～30％，培养不少于34h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DM培养基中含有甘油15～20g/L，磷酸二氢钾10～13.5g/L，柠檬酸1.0～2.0g/L，磷酸氢二氨3.0～5.0g/L，七水硫酸镁1.0～2.0g/L和微量金属元素5～10ml/L。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微量金属元素中含有水硫酸锌2.25g/L，硫酸亚铁10g/L，一水硫酸锰0.35g/L，无水硫酸铜1.0g/L，十水硼酸钠0.23g/L，二水氯化钙2.0g/L，钼酸铵0.11g/L。

10.权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌在医药、食品和化工领域生产乳酰-N-四糖的应用。