[发明专利]特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用

说明书

本发明涉及一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用，核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1‑3所示之一，对左旋咪唑具有高特异性和亲和力，并基于该核酸适配体开发了一种双模式纳米探针，包括核酸适配体、互补链、AuNPs/Cu‑TCPP(Fe)或AuNPs/Co‑TCPP(Fe)纳米片，在左旋咪唑检测中表现良好，具有高灵敏度和准确度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和应用。

背景技术

驱虫药用于预防或治疗影响体重增加的寄生虫感染。目前，驱虫药已广泛用于人类和兽医学以控制寄生虫侵扰。其中一种药物左旋咪唑已获准用于治疗包括家禽在内的各种动物的体内寄生虫感染。左旋咪唑主要用于治疗传染性寄生虫病，是一种合成的高效低毒的广谱驱虫药。其抗虫治疗效果显著，药源充足，应用历史悠久且性质稳定，对牛、羊、猪、家禽等多种动物的胃肠道线虫和肺线虫有良好的驱虫活性，广泛用于兽医实践。其驱虫机理为抑制延胡索酸还原酶活性，干扰能量代谢和充当乙酰胆碱激动剂，麻痹虫体。此外，左旋咪唑在寄生虫神经系统中充当乙酰胆碱激动剂，导致线虫肌肉的去极化，发生持续性收缩而致麻痹，使虫体不能附着于肠壁，寄生虫随之排出体外。

由于左旋咪唑具有良好的驱虫作用和免疫调节功能，受到畜牧养殖企业的青睐，在我国动物养殖业中有着广泛的应用。为确保食品安全，我国、美国、欧盟和日本等许多国家或国际组织都针对动物源性左旋咪唑的含量制定了严格的限量标准，一般为10-100μg/kg。不合理地使用左旋咪唑或不遵守停药期，动物组织左旋咪唑含量可能超过规定的最大残留限量值，随食物链间接被人体摄入，最终对消费者身体健康造成不良影响。

当前左旋咪唑的测定方法以色谱法为主，也会使用与不同检测器相结合的色谱技术。包括气相色谱法(GC-MS)、液相色谱(LC-UV、LC-MS、 LC-MS/MS)、高效液相色谱(HPLC、RP-HPLC、HPLC-UV、HPLC-MS)等。色谱法定性准确，但需要色谱级的有机试剂作流动相，运行成本较高且废液容易造成环境污染，需要昂贵的设备或复杂的预处理及专业技术人员操作，实际应用范围较窄。适配体是一种以指数富集配体系统进化(SELEX)技术从寡核苷酸文库中经体外筛选得到的高亲和力特异性结合靶标的单链寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)，通常由20-100个碱基组成，能与靶标特异性结合，被称为“化学抗体”。靶物质能够诱导适配体由自由构象折叠成G- 四链体、发夹、假结等三维空间结构，与适配体特定位点通过氢键、疏水作用力、范德华力等与适配体发生非共价结合。高亲和性高特异性适配体序列的获得是适配体技术的核心。SELEX技术是目前最常用的适配体筛选手段。与大多数需要将靶标固定在固相介质上的SELEX方法相比，Capture-SELEX 的主要优势是将DNA文库而不是靶标固定在固相介质上，能够针对无法固定的小分子靶标的适配体筛选，保持了靶标的原始结构。目前适配体在兽药残留检测中已有一定的应用，但尚未有关于左旋咪唑特异性适配体筛选研究的报道。基于此，开发一种灵敏、高效、简便针对左旋咪唑残留的适配体检测新技术具有非常重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体，具有特异性高、稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，并基于该核酸适配体开发了一种双模式探针，可用于左旋咪唑的检测。

本发明的第一个目的是提供一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1-3所示之一，具体序列为：

LEV-5：

5′-AATCAAACGCTAAGGTCAAGGGAGAGTGCACCCATTCTTGGGG CCCCGGGCCAGCCCCGACACGCCGCCGAAGCTTGGTACCCGTATCGT-3 ′；

LEV-1：