[发明专利]用于检测SARS-CoV-2及其突变株的引物组、试剂和试剂盒及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了用于检测SARS‑CoV‑2及其突变株的引物组、试剂和试剂盒及应用，所述引物组核苷酸如SEQ ID NO.1~6所示的单链DNA分子。采用本申请引物组合基于LAMP检测体系可快速检测样本中的多种新冠病毒株，具有检出限低，特异性好的优点，且降低了核酸检测的技术门槛，普通人经过简单培训便能进行操作满足对病毒的核酸检测。

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测SARS-CoV-2及其突变株的引物组、试剂和试剂盒及应用。

背景技术

新型冠状病毒，2020年1月12日被世界卫生组织命名为2019-nCoV，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2。SARS-CoV-2是一种新型冠状病毒，其传播途径主要包括飞沫传播、接触传播和气溶胶传播。感染SARS-CoV-2的患者可能出现发热、咳嗽、气促和呼吸困难等症状，严重的情况可能导致肺炎、急性呼吸窘迫综合症或合并严重呼吸道并发症。

由于SARS-CoV-2是单链RNA病毒，其RNA聚合酶缺乏校对功能，病毒易发生突变。目前变异的新冠病毒主要有五大类，分别是Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron。研究者发现，在delta变异株中，突变氨基酸残基的数量为18个，而在omicron中则高达43个，且在其表面刺突蛋白上的变异就有32处，而新冠病毒正是通过刺突蛋白与人类细胞受体结合感染人体的。易发生突变是多数RNA病毒的一种固有性质，这有可能导致之前感染或接种疫苗产生的抗体无法识别变异后的新冠病毒，同时病毒的核酸序列的改变，也会影响现有的核酸检测的准确性。为了尽早对感染者做出诊断以及有效的隔离，急需针对SARS-CoV-2及其突变株的同步检测体系。

目前对于新冠筛查主要采用荧光定量PCR法，需要价格高昂的设备和专业的操作技术人员，且检测时间长，不利于大规模的检测，目前仅是作为实验研究使用。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。且LAMP反应可以直接在同一反应体系中完成RNA逆转录和PCR扩增反应，省去了逆转录的操作步骤和时间，也降低了多次操作可能带入污染物的风险。该技术除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR进行凝胶电泳，反应产生的大量焦磷酸镁沉淀会使管内出现白色浑浊现象，因此可以将反应液是否有白色沉淀作为判读标准，肉眼即可判断样本内是否含有病毒的核酸，无需借助其它仪器检测，简便快捷，适合基层快速诊断。

发明内容

为提高SARS-CoV-2及其突变株感染者大规模筛查的准确性和检测速度，本申请基于LAMP法构建了一种同步检测SARS-CoV-2及其突变株的检测体系，实现对感染者全面的快速筛查以防止病毒传播，保证患者得到及时治疗具有重大意义。

为了实现本申请的技术目的，本申请主要包括以下技术内容：

作为本申请的第一个实施方案，提供了一种基于LAMP法检测SARS-CoV-2及其突变株的引物组，所述引物组主要由外引物对、内引物对组成；

所述的外引物对如下(a1)或(a2)：

(a1)如SEQ ID NO.1～2所示的单链DNA分子；

(a2)将(a1)中所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；

所述内引物对为如下(b1)或(b2)：