[发明专利]一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用。该耐草铵膦转基因玉米BrmB01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22650。本发明还建立了用于检测待测植物样品是否来源于所述转基因玉米BrmB01的PCR检测方法，该检测方法可以鉴定插入的外源DNA分子和植物基因组DNA的接合区域，进一步可用于准确快速的鉴定植物样品中是否包含特定转基因玉米事件BrmB01的DNA分子，为培育具有优良性状的耐草铵膦玉米品种研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与检测方法及其应用，特别涉及一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备方法、用于检测耐草铵膦转基因玉米BrmB01的核苷酸序列及其检测方法。

背景技术

杂草不但通过与玉米争光、争水、争肥造成直接减产，还通过为许多病虫提供寄生和越冬场所而引发病虫害导致减产。因此，玉米杂草防治是保障高产稳产的重要举措。

草铵膦是铵盐草胺磷的简称。它是一种广谱触杀型除草剂，用来控制作物生长后的大范围杂草生长。草铵膦的活性成分是L-草丁膦，是谷氨酰胺合酶的抑制剂。谷氨酰胺合酶能催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，它的活性被抑制后将导致氨的积累和谷氨酸水平降低，从而抑制光合作用，使植物在几天内死亡。草铵磷乙酰转移酶能通过乙酰化使草铵膦脱毒成一种无活性的化合物，从而避免了对植物造成伤害。bar基因编码的草丁膦乙酰CoA转移酶(PAT)来源于吸水链霉菌，将bar基因导入作物中能赋予作物对草铵膦的耐受性。

通过草铵膦抗性筛选和表达量分析，可以获得具有商业化应用前景的转化体事件，采用回交转育等常规育种方法，将获得的转化体事件转育到不同遗传背景的玉米中，可以培育出具有原始转化体事件的转基因表达特征的耐草铵膦玉米品种。

每个转化体事件都具有特异的外源插入序列与植物基因组的连接区序列，以外源插入序列与植物基因组连接区序列为检测目标能特异和准确的对转化体事件进行鉴定。通过转化体特异PCR检测或Southern杂交能检测目标转化体的存在。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐草铵膦的转基因玉米BrmB01的制备与检测方法。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种耐草铵膦转基因玉米的培育方法。

本发明提供的耐草铵膦转基因玉米的培育方法包括如下步骤：将外源DNA分子插入目的玉米基因组中，得到耐草铵膦转基因玉米；

所述外源DNA分子为含有草丁膦乙酰CoA转移酶编码基因(SEQ ID No.1第1835-2386位)的DNA分子；

所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米中的上游侧翼序列为上游插入位点起向其上游方向延伸得到的任意一个DNA片段；

所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米中的下游侧翼序列为下游插入位点起向其下游方向延伸得到的任意一个DNA片段；

所述上游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ ID No.1第1-516位所示的DNA分子中的最后一个核苷酸对应的位点；

所述下游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ ID No.1第2664-3034位所示的DNA分子中的第一个核苷酸对应的位点。

上述方法中，所述插入为插入所述上游插入位点和所述下游插入位点之间，即替换玉米基因组中所述上游插入位点和所述下游插入位点之间的核苷酸。

进一步的，所述耐草铵膦转基因玉米含有特异DNA片段；所述特异DNA片段含有SEQID No.2所示的DNA分子和/或SEQ ID No.3所示的DNA分子。

再进一步的，所述特异DNA片段含有SEQ ID No.4所示的DNA分子和/或SEQ IDNo.5所示的DNA分子。