[发明专利]铁缺乏小鼠小肠类器官模型的构建方法及应用

说明书

本发明公开了铁缺乏小鼠小肠类器官模型的构建方法及应用。在小鼠小肠类器官培养基中加入500μM的铁螯合剂DFO试剂，混匀静置培养48h后实现体外铁缺乏小鼠肠道类器官模型的构建。构建的体外铁缺乏小鼠小肠类器官模型，可用于探究铁缺乏对肠道干细胞增殖分化的影响及其作用机制，可用于研究铁缺乏对肠道健康的影响和药物筛选。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别是涉及铁螯合剂DFO构建铁缺乏小鼠小肠类器官模型的方法及应用。

背景技术

缺铁是造成全球疾病负担的主要因素之一，是全球疾病和健康的重要挑战。对儿童和孕妇的影响尤其显著。除此之外，在畜禽生产中，初生仔猪容易出现缺铁性贫血，初生仔猪体组织铁含量低，母猪初乳与常乳中铁含量不能满足仔猪快速生长发育的需求，且仔猪胃酸分泌较少，对铁吸收的促进作用较弱，因此仔猪容易罹患缺铁性贫血。铁缺乏的仔猪会出现皮肤苍白、食欲减退、生长发育迟缓等症状，会对畜牧生产带来极大的损失。除此之外，缺铁已经证明与多种疾病相关，如缺铁性贫血、炎症性肠病、神经功能障碍、胎儿生长迟缓、不宁腿综合征等。

肠道是全身上下最大的吸收场所和免疫器官，对机体的生长发育至关重要。肠道类器官指的是由肠道隐窝或干细胞在3D培养条件下生成的具有肠上皮结构和功能的类似于花环状的囊状细胞团，能在体外模拟体内肠道的自我更新，又称为“mini-gut （迷你肠道）”。其中小肠肠道类器官英文为enteroid，结肠肠道类器官英文为colonoid。机体铁代谢与肠道健康与发育密切相关，铁缺乏对肠道的影响主要聚焦在肠道屏障与肠上皮细胞的相关研究方面，但对肠道干细胞增殖分化的影响相关研究未见报道。如果有方法可以建立起正常生理条件下肠道铁缺乏的模型，那么将为后续研究铁缺乏对肠道干细胞生长发育奠定基础，有助于进一步研究铁缺乏在正常生理条件下在肠道的作用机制，对后续铁缺乏的生理生化研究有重要意义。

目前仍没有方法可以系统建立体外小肠类器官铁缺乏的细胞模型，所以当前生物医药领域亟需一种可以稳定、高效、全面、便捷建立铁缺乏小肠类器官的方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供铁缺乏小鼠小肠类器官模型的构建方法及应用。

一种铁缺乏小鼠小肠类器官模型的构建方法，包括：

步骤一，首先是小鼠小肠类器官的获取，小鼠安乐死后用75%的酒精给小鼠腹部擦拭消毒，用手术剪剪开小鼠腹部皮肤及腹膜，剪取15 cm的小肠肠段，放入预冷的PBS缓冲液中，祛除小肠肠段上的肠系膜与脂肪；

步骤二，用注射器吸取PBS溶液冲洗肠道中的食糜，弃废液，在PBS溶液中纵向剪开肠道，暴露肠绒毛，用冰PBS溶液清洗肠道直至PBS溶液澄清；

步骤三，1 mL的0.5 M EDTA溶液加到25 mL 的冰PBS中配成1 mM EDTA溶液，将肠段剪成2~5 mm的小段，放入配好的EDTA溶液中，在摇床上轻晃使肠段刚好完全摇晃起来，30min；

步骤四，摇晃结束后，弃掉废液，吸尽EDTA溶液，加入25 mL冰PBS溶液，轻柔颠倒混匀数次后静置，随后弃掉废液，小心吸尽PBS溶液后将肠段倒入干净的培养皿中，吸尽多余的PBS溶液，将肠段集中摆放，加入5 mL的冰PBS溶液反复吹打肠段，使隐窝和绒毛分离；

步骤五，在50 mL离心管口装上70 μm细胞滤网，将上步骤四中吹打均匀的混合液通过70 μm细胞滤网以去除多余的绒毛；

步骤六，取500 μL步骤五中过滤后的混合液加于新的离心管中，于掌上离心机离心5 min。弃上清，以小肠类器官培养基：Matrigel = 1:1 的比例，将隐窝小心吹打重悬，不要有气泡；

步骤七，拿出预热的48孔细胞培养板，每孔加入30 μL步骤六中的重悬液，形成立体的液滴，