[发明专利]铁缺乏小鼠小肠类器官模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种铁缺乏小鼠小肠类器官模型的构建方法，其特征在于，包括：

步骤一，首先是小鼠小肠类器官的获取，小鼠安乐死后用75%的酒精给小鼠腹部擦拭消毒，用手术剪剪开小鼠腹部皮肤及腹膜，剪取15 cm的小肠肠段，放入预冷的PBS缓冲液中，祛除小肠肠段上的肠系膜与脂肪；

步骤二，用注射器吸取PBS溶液冲洗肠道中的食糜，弃废液，在PBS溶液中纵向剪开肠道，暴露肠绒毛，用冰PBS溶液清洗肠道直至PBS溶液澄清；

步骤三，1 mL的0.5 M EDTA溶液加到25 mL 的冰PBS中配成1 mM EDTA溶液，将肠段剪成2~5 mm的小段，放入配好的EDTA溶液中，在摇床上轻晃使肠段刚好完全摇晃起来，30min；

步骤四，摇晃结束后，弃掉废液，吸尽EDTA溶液，加入25 mL冰PBS溶液，轻柔颠倒混匀数次后静置，随后弃掉废液，小心吸尽PBS溶液后将肠段倒入干净的培养皿中，吸尽多余的PBS溶液，将肠段集中摆放，加入5 mL的冰PBS溶液反复吹打肠段，使隐窝和绒毛分离；

步骤五，在50 mL离心管口装上70 μm细胞滤网，将上步骤四中吹打均匀的混合液通过70 μm细胞滤网以去除多余的绒毛；

步骤六，取500 μL步骤五中过滤后的混合液加于新的离心管中，于掌上离心机离心5min；

弃上清，以小肠类器官培养基：Matrigel = 1:1 的比例，将隐窝小心吹打重悬，不要有气泡；

步骤七，拿出预热的48孔细胞培养板，每孔加入30 μL步骤六中的重悬液，形成立体的液滴，

于37℃细胞培养箱中静置8 min使Matrigel凝固，当Matrigel凝固后取出培养板，每孔贴壁加入300 μL小肠类器官培养基，剩余的孔加入1 mL PBS溶液以保持湿度，放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养，观察小肠类器官状态，每2 d换液，每6 d传代；

步骤八，铁螯合剂DFO以终浓度为500 μM溶于小鼠小肠类器官生长培养基中，混匀后将小鼠小肠类器官培养皿放在37℃，5% CO₂细胞培养箱中培养48 h。

2.一种如权利要求1所述的构建方法得到的铁缺乏小鼠小肠类器官模型的应用，其特征在于，

小鼠小肠类器官模型在体外发生铁缺乏，表现小肠类器官生长不佳、铁转运相关基因乳铁蛋白（Lactoferrin）和膜铁转运蛋白1（Ferroportin 1）的表达均显著升高、铁储存蛋白铁蛋白重链（Ferritin heavy chain）的基因表达略有下降的趋势；用于建立探究铁缺乏对肠道干细胞增殖和分化的影响及其作用机制。

3.一种如权利要求1所述的构建方法得到的铁缺乏小鼠小肠类器官模型的应用，其特征在于，小鼠小肠类器官模型在体外发生铁缺乏，表现小肠类器官生长不佳、铁转运相关基因乳铁蛋白和膜铁转运蛋白1的表达均显著升高、铁储存蛋白铁蛋白重链的基因表达略有下降的趋势；用于铁缺乏对炎症性肠病、肠道损伤再生、肠癌肠道疾病的影响的相关研究与药物研发。