[发明专利]菠萝AcKNOX1基因、克隆方法、表达载体及应用

说明书

本发明公开菠萝AcKNOX1基因、克隆方法、表达载体及应用，提取菠萝总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AcKNOX1基因的全长cDNA，与载体连接，转化大肠杆菌Trans‑T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到蜻蜓凤梨AcKNOX1基因，该基因的cDNA全长1508bp，编码含329个氨基酸残基的蛋白质。利用实时荧光定量PCR测定了不同叶缘形态菠萝叶片中AcKNOX1基因的表达水平，AcKNOX1在无叶刺菠萝叶边缘中相对表达量显著低于有叶刺菠萝。在菠萝叶缘中成功获得AcKNOX1基因的启动子，对其启动子分析发现具有赤霉素、细胞分裂素和脱落酸等多种激素的响应元件，可能调控激素合成途径中相关基因的表达，影响植物生长发育；AcKNOX1基因的获得，有助于了解菠萝叶形发育的调控机制。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及菠萝AcKNOX1基因、克隆、表达特性分析、表达载体构建、对乙烯的响应途径和对开花的调控作用。

背景技术

菠萝(Ananas comosus)隶属于凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)，作为一种热带季节性水果以其优良的营养特性而闻名，也是全球最具有经济价值的水果之一。在菠萝众多的品系中，其叶缘形态可分为三类：完全无刺、完全有刺和部分有刺。近年来，我国菠萝产业一直保持稳定发展态势，但远不能满足市场需求，产品主要依赖于进口。除受限于种植区域，菠萝有刺品种的叶刺，给栽培管理和人工采收造成很多不便，劳动力成本上升的同时也妨碍了有刺品种的引进。若能培育出刺少甚至无刺的菠萝品种，将极大提高菠萝田间管理的工作效率。因此培育无刺品种，是菠萝育种的重要目标之一，也是菠萝育种的关键问题。虽然利用分子手段改良菠萝叶缘的案例未见报道，但随着对叶缘锯齿研究的深入，人为调控植物叶缘性状成为可能，该研究将为无刺品种的开发提供理论指导。

通过菠萝比较转录组信息分析获得了KNOX1基因的片段，BLAST对比显示均与其他植物中的KNOX1基因具有较高的同源性，定名为AcKNOX1。实时荧光定量PCR结果表明，基因表达分析表明，在不同形态的叶缘中，AcKNOX1基因在无叶刺菠萝叶边缘中相对表达量显著低于有叶刺菠萝；赤霉素、细胞分裂素和脱落酸三种激素处理菠萝幼苗后，AcKNOX1在菠萝幼苗中的表达量呈现先上升后下降的趋势，且分别在8h、12h和12h相对表达量达到峰值，表明这三种激素均能诱导AcKNOX1基因的表达。亚细胞定位鉴定发现其可在细胞核发挥功能；克隆获得AcKNOX1启动子并分析其具有光响应元件、厌氧诱导顺式调控元件和环境胁迫响应元件等调控元件，表明AcKNOX1基因可能还参与其它生物学途径。利用PCR克隆了基因的全长序列并构建表达载体，转35S::AcKNOX1阳性植株幼苗期叶片即出现裂刻，生长过程中叶面向内皱缩，叶缘裂刻加深，叶表皮毛明显增加，表明菠萝AcKNOX1基因可能影响菠萝叶缘发育过程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菠萝AcKNOX1基因，提取菠萝总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AcKNOX1基因的全长cDNA，与-blunt载体连接，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到菠萝AcKNOX1基因，该基因的cDNA全长1508bp。AcKNOX1基因的获得，为研究菠萝叶刺形成机理奠定了基础，为菠萝功能基因的克隆与鉴定、无刺品种种质资源的鉴定评价及无刺品种选育提供依据，具有重要的理论及实践意义。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种菠萝AcKNOX1基因，该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种菠萝AcKNOX1基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)以菠萝(Aechemia fasciata)为材料，利用CTAB法提取总RNA；

(2)AcKNOX1基因的克隆；